六種家畜乳氨基酸特征聚類分析

我國牛羊乳業(yè)高速發(fā)展的同時，馬、駱駝、牦牛和水牛等家畜乳也得到區(qū)域性開發(fā)。特種家畜乳因風味獨特、營養(yǎng)價值高和產量低等特點，極易被低價位牛羊乳或其他原料摻假或冒充，破壞乳的完整性、真實性及功能屬性[1]。不僅侵害消費者健康和尊嚴，也破壞正常市場競爭秩序，更不利于民族和地區(qū)特種家畜乳業(yè)健康發(fā)展[2]。乳是人類膳食蛋白質及氨基酸(amino acids，AA)的重要來源，哪種乳蛋白更接近人體，尤其是哪種乳更符合嬰幼兒的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)模式，成為亟待解決的重要問題。隨著化學計量學及食品組學大數據檢測分析技術的不斷發(fā)展，各種家畜乳AA特征及營養(yǎng)價值的微妙差異應該重新探討、認識和評價。

乳蛋白質和肽存在物種特異性，可用于乳的物種來源真實性判別。吳亞君等[3]利用毛細管電泳技術比較了牛和羊乳蛋白電泳圖譜，發(fā)現牛和羊乳的電泳圖譜存在差異。馬露[4]報道了馬、山羊、駝和牦牛4種家畜乳蛋白的反相高效液相色譜圖存在種屬特異性，利用其圖譜可以很好地區(qū)分乳的物種來源。EL-HATMI等[5]通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術比較了牛、山羊、驢、駱駝和人乳乳清蛋白的電泳圖譜，發(fā)現可判別乳樣的物種真實性。但不同動物乳蛋白質或肽水解獲得的AA，是否還存在物種或其他分類特異性，這種特異性是否可以實現特種家畜乳完整性和真實性判別，有待進一步研究。烏恩其[6]以組織液中的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)為目標物種特異蛋白，建立用經典免疫學方法檢驗牛、羊和駱駝肉中摻假的馬肉、鴨肉和豬肉等；乳中也含IgG，因此以IgG為目標蛋白也可檢測高價格特種家畜乳中摻假牛乳。近些年有研究開始借助化學計量學研究食品營養(yǎng)素組或營養(yǎng)素指紋，如氨基酸指紋、脂肪酸指紋與物種特異性及其他決定和影響因素的關系模型。郭軍等[2]提出了以脂肪酸和氨基酸指紋進行原奶和液態(tài)乳真實性的鑒別方法。呂中旺等[7]對牛、山羊、水牛和牦牛4種家畜乳AA進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，發(fā)現不同家畜乳有分離趨勢，但未進行建模驗證。郭珍琪[8]和張鑫等[9]利用化學計量學研究不同家畜乳的脂肪酸組成，發(fā)現家畜乳的脂肪酸構成存在顯著的物種差異，同時也發(fā)現脂肪酸構成也與飼養(yǎng)模式及加工等分類因素有關。SMIDDY等[10]利用牛、水牛、綿羊、山羊、驢、馬和駝乳的甘油三酯做PCA，結果顯示家畜乳在得分向量圖中明顯分離，且聚類特征符合物種分類學規(guī)律，劉宇婷等[11]也印證了同樣的結果。

傳統(tǒng)描述性統(tǒng)計和差異檢驗的基本數學原理和構架基于單變量和數據的線性規(guī)律，無法對多指標、向量、矩陣等大數據進行分析。多變量統(tǒng)計學和化學計量學的發(fā)展為解析和挖掘數據串、數據矩陣等大數據結構和隱藏的規(guī)律模式、利用食物大數據描繪和分類食物提供了無限的可能[2]。本研究旨在利用現代化學計量學聚類和判別分析手段，探索和比較牛乳和特種家畜乳AA整體特征，同時相對于人乳必需氨基酸模式，利用新的策略和手段篩選AA更接近人乳的乳種類，以期為乳及乳制品數據庫的健全、特種家畜乳的開發(fā)與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 乳樣

從內蒙古、四川和廣西地區(qū)采集代表性乳樣55份。其中荷斯坦牛(牛)乳15份，采自內蒙古巴彥淖爾和呼倫貝爾；蒙古馬乳15份，采自內蒙古呼倫貝爾、錫林郭勒和鄂爾多斯；駝乳10份，采自內蒙古阿拉善和呼倫貝爾；山羊乳5份，采自內蒙古鄂爾多斯；牦牛乳5份，采自四川紅原地區(qū)；水牛乳5份，采自廣西南寧。樣品采集后分裝于離心管，密封并用液氮迅速冷卻，凍藏于-20 ℃冰柜備用。樣品置室溫解凍后，均質取樣用于AA的測定。每個乳樣2次平行測定的AA值都用于聚類分析。

1.1.2 藥品試劑

17種AA混合標準品，美國Sigma公司；CDAA-270019-200 mg L-色氨酸，上海安譜實驗科技有限責任公司；濃鹽酸(優(yōu)級純)，國藥化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)、冰乙酸、異丙醇(色譜純)、氫氧化鈉(優(yōu)級純)，麥克林化學試劑有限公司；茚三酮、鉀鈉緩沖液、BUFFER A-1、BUFFER B-1、再生液，賽卡姆(北京)科學儀器有限公司。

1.1.3 儀器設備

S-433D全自動氨基酸分析儀，德國賽卡姆公司；HN200多功能氮吹儀，海能儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸測定

參照GB 5009.124—2016酸水解法測定17種AA(除色氨酸)，參照GB/T 15400—2018堿水解法測定色氨酸。每個樣品做2個平行，使用S-433D全自動氨基酸分析儀進行測定。色譜條件：使用水解氨基酸分析柱LCAK06/Na(4.6 mm×150 mm)；柱溫58～74 ℃梯度控溫；反應溫度130 ℃；流動相流速0.45 mL/min；茚三酮流速0.25 mL/min；檢測器440 nm/570 nm雙波長檢測器；進樣體積50 μL。

1.2.2 統(tǒng)計分析

本研究乳樣2輪測定都直接用于分析，即55份乳樣，進行2輪平行AA測定，獲得110組數據，進行數據整理和質量檢驗，剔除了4組界外數據，有106組數據用于描述性統(tǒng)計和后續(xù)的聚類分析。平行測定數據納入聚類分析，等同于引入和觀察測定變異的影響，可增加模型穩(wěn)健度。

以聯合國糧農組織/世界衛(wèi)生組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO)2007發(fā)布的935號報告中的混合人乳AA數據進行參照和比較研究[12]。

EAA模式以色氨酸含量為1分別計算其他EAA相應的比值[13]。

用IBM-SPSS 20.0進行描述性統(tǒng)計和差異檢驗，對6種家畜乳18種AA絕對含量、百分含量和EAA模式數據的整體差異均進行配伍方差分析，每種AA絕對含量和百分含量在物種間的差異做單因素方差分析，結果用表示。用化學計量學軟件Pirouette 4.5(美國Infometrix公司)對AA百分含量及EAA模式數據分別進行PCA，觀察乳樣的自然聚類特性，探討以AA建模判別乳的物種真實性的可行性，以及判斷哪種家畜乳AA或EAA更接近人乳。并利用AA百分含量建立軟獨立建模分類(soft independent modeling of class analogies，SIMCA)判別模型，對被檢乳樣及人乳數據進行有監(jiān)督的分類/判別分析。SIMCA模型內部驗證：用所有55份乳樣2個AA平行測定值(剔除4個異常值，即106組數據)進行建模，再對建模乳樣物種進行鑒定(軟件可自動完成)；SIMCA模型外部驗證：人工隨機抽出10～12組數據，用其余94～96組數據建模，對抽出的樣本數據進行判別；這種隨機組合建模驗證重復20次；人乳數據不參與建模，僅用于判別。累計驗證樣本221組。

2 結果與分析

2.1 六種家畜乳氨基酸特征

6種家畜和人乳AA絕對含量(mg/g)描述性統(tǒng)計結果見表1，AA百分含量[AA/總氨基酸(total amino acid，TAA),%]統(tǒng)計結果見表2，PCA結果見圖1。

2.1.1 氨基酸絕對含量特征

6種家畜乳AA配伍方差分析整體差異極顯著(P<0.01)，每一種氨基酸在物種間均有差異。TAA(相當于總蛋白)含量由高到低依次為：牦牛和水牛乳(差異不顯著)、山羊乳和駝乳(差異不顯著)、牛乳和馬乳。家畜乳TAA含量均高于人乳，其中牦牛乳TAA含量約為人乳的5.4倍；馬乳最稀薄，TAA約為人乳的1.7倍。6種家畜乳EAA/TAA均達41.75%以上，EAA/NEAA均達71.86%以上，都符合并高于FAO/WHO理想蛋白相應指標40%和60%的標準[12]；計算FAO/WHO公布混合人乳EAA/TAA為42.96%，EAA/非必需氨基酸(nonessential amino acid,NEAA)NEAA為75.32%。

6種家畜乳EAA中含量最高的為Leu，其次為Lys和Val；NEAA含量最高的為Glu，其次為Pro和Asp；牦牛乳中Leu、Phe、His、Lys、Gly、Ala和Arg含量顯著或極顯著的高于其他5種家畜乳。水牛乳中Thr、Asp、Glu、Cys和Tyr含量顯著或極顯著高于其他5種家畜乳。山羊乳中Trp含量顯著高于其他5種家畜乳。

表1 六種家畜乳和人乳AA含量 單位：mg/g乳樣

Table 1 Amino acid in six animals milk and human milk 

注：*表示FAO/WHO 公布的混合人乳數據[12](下同)，每一種AA做單因素方差分析，不同小寫字母表示差異顯著或極顯著，6種家畜乳以AA均值做配伍方差分析(下同)，TAA值行標注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

2.1.2 氨基酸百分含量特征

6種家畜乳和人乳AA%結果統(tǒng)計見表2。對AA%均值的配伍方差分析，物種間無顯著差異(P=1.000)，而在PCA和SIMCA分析均清晰顯示家畜乳以AA構成聚類符合物種分類學規(guī)律，說明傳統(tǒng)統(tǒng)計對AA%整體差異不敏感。

牛乳中Lys%含量顯著高于其他5種家畜乳；Leu%顯著高于馬、山羊、牦牛和水牛乳，與駝乳無顯著差異。牦牛乳中Pro%顯著高于駝乳、山羊乳、水牛乳、牛乳和馬乳。水牛乳中Glu%顯著高于其他5種家畜乳。山羊乳中Thr%、Val%、Phe%和Trp%顯著高于其他家畜乳，其中Trp%約為其他5種家畜乳的1.2～1.5倍，牛乳含量最高，駝乳和馬乳次之，牦牛乳最低。駝乳中Met%、IIe%和Leu%含量高于其他家畜乳。馬乳中His%、Asp%、Ala%和Arg%顯著高于其他5種家畜乳，Ser%顯著高于水牛、牛和牦牛乳，與山羊乳無顯著差異。人乳中Trp%、Gly%、Cys%和Tyr%高于6種家畜乳。

表2 六種家畜和人乳氨基酸百分含量(氨基酸/總氨基酸) 單位:%

Table 2 Amino acids percentage of six animals and human milk (AA/TAA)

注：物種間無顯著差異(P=1.000)

家畜乳和人乳AA%的PCA結果見圖1-a。6種家畜乳樣在三維空間自然聚類的距離遠近符合物種分類學規(guī)律。牛、牦牛、水牛和山羊乳4種?？凭垲愅粎^(qū)域(主因子1和主因子2相區(qū))，而馬乳和駝乳分布在另外2個區(qū)域：同屬偶蹄類的駝乳樣品在主因子1軸下側與?？苿游飳?，但距離較遠；馬乳分布在偶蹄類對面，距離較遠。人乳空間投射點距家畜乳聚類群較遠，相對而言人乳與馬乳最接近，說明不同物種乳樣的AA特征存在顯著差異。主因子1集合的AA共性(聚類貢獻)僅為44.6%，而主因子2和3分別為16.9%和10.3%，說明動物乳中AA間的相關性并不大。

由圖1-b可知不同乳樣的特征氨基酸，人乳為Trp、Cys、Asp和Arg，馬乳為Ala和His，駝乳為Ile和Leu，山羊乳為Ser和Phe，牛乳為Lys，牦牛乳為Pro，水牛乳為Glu，與AA%的描述性統(tǒng)計結果基本一致。

2.2 六種家畜乳必需氨基酸模式分析

6種家畜乳和人乳EAA模式值統(tǒng)計結果見表3，所有乳樣EAA模式值的PCA結果見圖2。6種家畜和FAO/WHO發(fā)布的混合人乳EAA模式值均值配伍方差分析差異極顯著(P<0.01)。家畜乳EAA中含硫氨酸(Met+Cys)模式值最接近人乳，其他EAA值均高于人乳。從EAA模式值的總均值來看，山羊(4.57)和馬乳(4.63)最接近人乳(3.14)，其他動物乳EAA模式值均值為人乳的1.8～2.2倍。

a-得分向量圖；b-根向量圖
圖1 六種家畜和人乳氨基酸PCA
Fig.1 PCA of amino acids of different specie milk

EAA模式值PCA結果顯示，6種家畜乳相對集中，與人乳距離遠，說明人乳EAA模式與動物乳差異大。主因子1集合了EAA共性為89.9%，說明EAA相關性較大，而主因子2僅聚集了7.8%的EAA共性。在主因子1軸上，山羊乳、馬乳與人乳分布距離最接近，其次是牛乳、駝乳、水牛乳和牦牛乳，與EAA模式的配伍方差分析結果一致，也與EAA模式值的總均值分析結果一致。顯然PCA結果更直觀。

6種家畜乳和人乳中9種EAA的構成比例由高到低依次為Leu、Phe+Tyr、Lys、Val、Ile、Thr、His和含硫氨酸，其中含量較少的EAA有Trp和含硫氨酸，屬于限制性AA。

表3 六種家畜乳和人乳的氨基酸模式
Table 3 Amino acid patterns in six livestock milk and human milk

注：對乳樣的EAA模式進行配伍方差分析，同行不同小寫字母間差異極顯著(P<0.01)

圖2 六種家畜乳和人乳的氨基酸模式PCA
Fig.2 PCA of amino acid patterns in six livestock milk and human milk

2.3 六種家畜乳SMICA模型的建立及判別

家畜乳AA構成和EAA模式的PCA均證明家畜乳AA構成存在顯著的物種特異性，乳樣的自然聚類符合這些哺乳動物物種分類學親緣關系。但PCA實際上不是分類和判別分析的專用工具，因此本研究進一步利用家畜乳AA%數據建立了SIMCA判別模型(圖3)，對6種家畜乳進行有監(jiān)督的聚類分析，物種判別模型效果見圖3-a。6種家畜乳樣在SIMCA模型圖中的聚類符合物種親緣遠近。牛、牦牛、水牛和山羊乳4種牛科家畜乳的云圖分布于同一相區(qū)，共同聚類于三維圖右上方；同為偶蹄類的駝乳聚集在PC1軸對面，但與?？苿游锞垲惡苓h。而馬屬動物的蒙古馬乳聚類云出現在三維圖左側(PC1軸負值側)，與偶蹄類對應，距離較遠?？傊?，SIMCA結果與PCA一致，但作為有監(jiān)督的聚類和判別分析方法，SIMCA的效果更好。

a-牛乳、馬乳、駝乳、山羊乳、牦牛乳、水牛乳；b-人乳
圖3 不同物種乳樣氨基酸的SIMCA模型
Fig.3 Amino acid fingerprint SIMCA model of milk samples of different species

SIMCA模型內部驗證和外部驗證的樣本集及驗證結果見表4。用55份乳樣平行測定結果建立的模型逐一對每個樣品判別，即內部驗證，結果準確率為100%；多次隨機抽出一部分樣品數據，用剩余的樣品建立模型，再對未建模樣品進行判別，即外部驗證，累計進行了221個樣品，共判別正確205個，判別正確率為92.76%，外部驗證錯誤出現在?？苿游锶榈呐袆e中，其中牛判別錯誤最少(表4)。將人乳樣品放入SIMCA模型進行外部驗證，人乳判別為“0”，判別圖周圍未出現任何動物乳聚類云(圖3-b)，即未被判別為任何一類動物乳序號(判斷正確)，進一步證明其AA構成與6種家畜乳都不符合。

表4 SIMCA驗證內部和外部模型
Table 4 Internal and external verification on SIMCA model

注：-表示人乳不參與建模

3 討論

蛋白質和肽存在的物種特異性，不僅取決于蛋白質的AA排列順序，更取決于蛋白質復雜的四級空間結構。蛋白質水解產生的18種AA，在不考慮其排列順序和基因決定的排列規(guī)律的情況下，也存在顯著的物種特異性。動物和植物蛋白AA構成差異很大，因此營養(yǎng)價值的差異也很大。而親緣非常相近的動物，尤其是不同動物乳蛋白水解產生的AA構成也存在很大的物種差異,按目前的傳統(tǒng)統(tǒng)計和營養(yǎng)學評價，較難說哪種動物乳蛋白或AA的營養(yǎng)價值更高。即便是存在差異，也不能被很好地觀測和表達。不同家畜乳蛋白含量(TAA含量)顯著不同，顯然其AA絕對含量差異很大，但蛋白質的主要營養(yǎng)價值取決于其AA的比例構成，決定于EAA模式，實際取決于其是否已接近人體的需要模式[13-14]。因此按照人乳的EAA模式進行評價比較貼切?；瘜W計量學理論及軟件分析技術的發(fā)展使得多指標、數據組和數據矩陣等大數據潛藏規(guī)律和模式的直觀分析有了無限可能，也有必要對乳蛋白AA指紋特征展開新一輪的研究和評價，為乳及乳品，以及其他食物營養(yǎng)價值評價，完整性和真實性判別引入新策略、原理和方法。

本研究發(fā)現6種家畜乳AA絕對含量存在極為顯著的物種差異，家畜乳TAA含量為FAO/WHO混合人乳的1.7～5.4倍；EAA/TAA和EAA/NEAA分別在41.75%、71.86%以上，高于FAO/WHO發(fā)布的理想蛋白標準[12]，因此按照傳統(tǒng)的蛋白質AA評價指標，各種動物乳蛋白都是優(yōu)質蛋白。不同家畜乳AA%整體相近，配伍方差分析無顯著差異，這與高玎玲等[15]研究結果一致。PCA可直觀看到不同家畜乳在三維空間自然聚類符合物種分類學規(guī)律，牛、牦牛、水牛和山羊乳4種牛科聚類同一區(qū)域，馬乳和駝乳遠遠分布在另外2個區(qū)域。人乳空間投射點距家畜乳聚類群較遠，說明人乳和家畜乳AA存在顯著差異，這與ROUCHER等[16]傳統(tǒng)統(tǒng)計分析研究結果一致，但PCA更加直觀。郭軍等[2]、高玎玲等[15]和孫慧陽[17]研究團隊分別報道了乳AA的PCA可區(qū)分物種，但并未觀察到以AA聚類可達到符合物種分類學規(guī)律的效果。明確了乳AA存在種屬差異，挖掘其AA的具體差異就更加明朗了，傳統(tǒng)統(tǒng)計不太確定的規(guī)律也可得到PCA的印證。乳中氨基酸組成比例存在種屬特性，PCA和SIMCA分析根向量圖(載荷圖)及分析軟件中的“建模能力”都可直接觀察到每種家畜乳的特征AA：山羊乳為Thr、Val、Trp和Phe，其Trp最接近人乳；馬乳為His、Asp、Ala、Ser和Arg；駝乳為Met、IIe和Leu；牛乳為Lys，且與描述性統(tǒng)計相互印證。古麗巴哈爾·卡吾力等[18]和李文婓等[19]檢測馬、駝、牛和山羊乳蛋白AA，并進行了傳統(tǒng)統(tǒng)計學分析。聚類分析和描述性統(tǒng)計，各有優(yōu)缺點，前者雖然直觀，但適合多分類樣本研究，不適合單個樣品及單因素分析。

氨基酸的營養(yǎng)價值不僅取決于“量”的水平，同時還受EAA所占比例等“質”的影響。家畜乳EAA模式與人乳EAA模式越接近，蛋白質營養(yǎng)價值相對較高[13]。PCA發(fā)現山羊和馬乳EAA構成最接近人乳，說明其EAA被機體利用程度高于其他4種家畜乳，這可能是山羊乳乳清蛋白、馬乳酪蛋白與人乳接近的原因[4, 20]。PCA與EAA模式數據總均值(表3)可相互印證，但實際上傳統(tǒng)營養(yǎng)學評價中通常并無以EAA模式總均值對比的習慣。

近年，判別分析逐漸應用于食物的真實性判別。MARIO等[21]用奶酪的近紅外光譜數據建立SIMCA模型，發(fā)現摻假物有明顯分離，模型可用于食物真實性判別。WANG等[22]證實了多元素分析方法可作為表征肉類來源的工具。姬彩霞等[23]論證了以牛肉脂肪酸指紋建立模型判別放牧和舍飼牛肉的可行性。本研究構建特種家畜乳SIMCA模型，將平行測定數據納入聚類分析，等于引入和觀察測定變異的影響，可增加模型穩(wěn)健度。乳樣的聚類符合物種親緣遠近，結果與PCA一致，但監(jiān)督的聚類分析效果更好。內部和外部驗證準確率分別為100%、92.76%，證明利用AA建立家畜乳物種真實性判別模型是可行的。外部驗證錯誤出現在牛科動物乳判別中，這可能是種屬親緣性的原因，應建立?？苿游锏膶Ｓ门袆e模型。此外AA組成還受家畜品種、胎次、年齡、泌乳期、飼養(yǎng)狀況、地區(qū)、季節(jié)和滅菌方式等因素影響[24-27]，后續(xù)應擴大樣本，以期建立更穩(wěn)健的家畜乳判別模型。

4 結論

6種家畜乳AA絕對含量和相對比例構成和EAA模式都存在物種差異。以18種AA聚類特征符合物種分類學規(guī)律，牛、牦牛、水牛和山羊4種?？苿游锶榫垲愅粋€相區(qū)，馬乳和駝乳遠遠分離。6種動物乳按18種AA構成，馬乳最接近人乳；按EAA模式山羊和馬乳與人乳相對最接近。

以AA構成建立模型，判別家畜乳真實性可行，家畜乳18種AA建立SIMCA物種判別模型，內部和外部驗證準確率分別為100%、92.76%；外部驗證錯誤出現在?？苿游锶榕袆e中；人乳與6種家畜乳都不符合，再次說明人乳AA與動物的差異很大?；瘜W計量學聚類分析比傳統(tǒng)描述性統(tǒng)計和營養(yǎng)學評價更能直觀全息呈現乳的AA整體特征，為評價乳品營養(yǎng)和真實性提供了創(chuàng)新策略、原理和方法，同時也為乳制品數據庫的健全和特種家畜乳的開發(fā)與利用提供參考依據。