市售飲料對變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌致齲性的影響

齲齒是最常見的口腔細菌感染性疾病之一。其中，學(xué)齡前兒童患齲齒即低齡兒童齲(early childhood caries，ECC)的發(fā)生率位居兒童疾病的首位，嚴重危害兒童的健康[1]。齲齒的發(fā)生與微生物[2]、飲食[3]、宿主生活習(xí)慣等因素密切相關(guān)，其中微生物主導(dǎo)的牙菌斑生物膜的形成是齲齒的始動因子。生物膜是口腔微生物在牙齒表面定植并不斷生長繁殖而形成的三維立體的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，能保護細菌免受藥物的侵害，較浮游狀態(tài)下顯著提高了藥物耐受性。變異鏈球菌具有很強的代謝蔗糖產(chǎn)酸并形成致齲性生物膜的能力，是公認的主要的致病菌。近年來臨床研究又發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌參與了齲齒的進程，在患ECC的兒童口腔菌斑生物膜中檢出大量的白色念珠菌和變異鏈球菌[4]，二者相互作用會形成致齲性更強的生物膜[5-6]。

兒童對糖類的偏好等不健康的飲食習(xí)慣往往會加重齲齒的發(fā)生，大部分的飲料均添加了大量的蔗糖。飲食中的糖類物質(zhì)可與齲病微生物形成的牙菌斑生物膜直接接觸，為微生物提供碳源，使微生物定點產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙齒脫礦，最后形成齲齒[7]。同時飲料中的酸也是重要的致齲因素[7]。不同類型飲料的酸和糖含量不同，故對齲齒具有不同程度的影響。羅彥妮[8]通過體外模型評定了4種乳飲料對變異鏈球菌生物膜的形成、產(chǎn)酸、牙齒脫礦等指標的影響，結(jié)果表明全脂牛奶致齲能力較低，椰奶具有較高的致齲能力，豆奶及核桃奶致齲能力處于中等水平；胡霞[9]通過采用Keyes經(jīng)典評分方法評價了去離子水、可口可樂、鮮橙多和雪碧在大鼠模型中的致齲性，結(jié)果表明可口可樂、鮮橙多和雪碧對大鼠的牙齒均有酸蝕作用，會導(dǎo)致齲齒。而兒童偏好的飲料對于ECC中主要致齲菌白色念珠菌和變異鏈球菌雙菌的致齲性影響尚未見報道。

牙菌斑生物膜的形成是齲病的始動因素，而飲料本身的酸會導(dǎo)致牙齒的酸蝕進而導(dǎo)致齲洞的產(chǎn)生。本研究以常見的市售飲料：碳酸飲料、果汁、乳制品和水為研究對象，探究它們的酸度、對雙菌生物膜形成量的影響、對羥基磷灰石脫礦程度等指標，以評價不同飲料對雙菌致齲性的影響，為兒童飲料的選擇提供參考，也為替代性飲料配方的改良提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

變異鏈球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175、白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 18804，中國普通微生物菌種保藏管理中心，現(xiàn)保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心；哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170，保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心；紫色桿菌(Chromobacterium violaceum)CV026，由江南大學(xué)食品安全與質(zhì)量控制中心姚衛(wèi)蓉老師惠贈。

結(jié)晶紫、甲醇、無水乙醇、羥基磷灰石，國藥滬試；人工唾液，北京百奧萊博科技有限公司；康寧96孔細胞培養(yǎng)板，南通市海之星實驗器材有限公司；2216E培養(yǎng)基，青島海博；C6-HSL，Sigma。

可口可樂、雪碧、芬達，可口可樂中國公司；冰糖雪梨、水晶葡萄、橙汁、純凈水，康師傅控股有限公司；純牛奶、酸奶，光明乳業(yè)股份有限公司；上述飲料均購自江南大學(xué)世紀華聯(lián)超市。

TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨17.0，酵母粉6.0，NaCl 5.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖2.5，K2HPO4 2.5，pH 7.0～7.4；YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母粉10；LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；以上培養(yǎng)基均在115 ℃高壓滅菌 20 min。AB培養(yǎng)基(mol/L)：0.3 NaCl，0.05 Mg2SO4、2%(質(zhì)量分數(shù))酸水解酪蛋白，115 ℃高壓滅菌 20 min后加入10 mL 1 mol/L的無菌磷酸鉀緩沖液，10 mL 0.1 mol/L的無菌精氨酸溶液和20 mL 50%(體積分數(shù))無菌甘油。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiscan Go全波長酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；臺式冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；NexION 350D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Perkin Elmer公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

取出-80 ℃保藏的變異鏈球菌ATCC 25175，以2%的接種量接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。以相同的接種量將白色念珠菌ATCC 18804接種于YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h。紫色桿菌CV026接種于含10 μg/mL卡鈉霉素的LB培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)過夜。哈維氏弧菌BB170接種于2216E液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)過夜。所有菌株均活化3代后再用于實驗。

1.3.2 不同飲料緩沖能力及pH的測定

通過pH滴定法檢測飲料的緩沖能力，并將pH值改變1個單位所需的1 mol/L HCl的物質(zhì)的量記錄為緩沖容量。測定培養(yǎng)前飲料的初始pH和飲料與致病菌混合體系培養(yǎng)后的pH[8]。

1.3.3 不同飲料對雙菌生物膜形成的影響

將變異鏈球菌和白色念珠菌以2%的接種量分別接種至新鮮質(zhì)量分數(shù)1%蔗糖的TSB和YPD培養(yǎng)基，于96孔板中加入致病菌菌懸液各75 μL，再加入50 μL待測飲料，對照以無菌純凈水代替。培養(yǎng)24 h后，去除上清液，用PBS小心清洗生物膜2遍，室溫靜置晾干生物膜后向每孔加入100 μL甲醇以固定生物膜，10 min后除去甲醇，自然晾干，加入100 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液，將生物膜染色30 min，染色結(jié)束后用PBS清洗2遍，每孔以體積分數(shù)33%的冰醋酸溶解，用酶標儀OD600 nm讀取吸光度值[10]。

1.3.4 不同飲料對雙菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

參考丁婷等[11]的方法，將紫色桿菌CV026涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，使用濾紙片法，加入10 μL雙菌共培養(yǎng)的上清液，室溫孵育1 h，之后在28 ℃下過夜培養(yǎng)。以C6-HSL作為陽性對照，甲醇作為陰性對照。在孔周圍觀察紫色光圈，有紫色圈說明群體感應(yīng)過程中會產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯(acylated homoserine lactones，AHL)。

參考ZHU等[12]的方法，采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法檢測變異鏈球菌和白色念珠菌種間自誘導(dǎo)分子AI-2的活性。在24孔板中加入變異鏈球菌和白色念珠菌菌懸液各375 μL，再加入250 μL待測飲料，對照以無菌水代替飲料，培養(yǎng)24 h后，收集、過濾獲得無菌上清液，備用?；罨蟮墓S氏弧菌BB170 接種于AB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)菌液OD595 nm為0.8左右，再用無菌新鮮AB培養(yǎng)基按 1∶2 000稀釋該菌液，混勻備用。按1∶50比例將上述收集的上清液與哈維氏弧菌BB170稀釋菌懸液混合。30 ℃、100 r/min 搖瓶培養(yǎng)5 h，避光條件下吸取200 μL于黑色不透明酶標板中，以多功能酶標儀于OD500 nm檢測哈維氏弧菌BB170化學(xué)發(fā)光情況，以無菌水作為陰性對照。

1.3.5 不同飲料對唾液包被羥基磷灰石鈣流失率的影響

參考秦蘇佳等[13]的方法，稍有改動。按照1 mg羥基磷灰石:200 μL人工唾液的比例充分混勻，取200 μL懸浮液包被96孔板，37 ℃孵育過夜。然后2 000 r/min離心10 min。棄上清液，風(fēng)干后的96孔板即為包被好的羥基磷灰石模型。

將唾液包被的羥基磷灰石放入96孔板中，將變異鏈球菌和白色念珠菌以2%的接種量分別接種至新鮮含1%蔗糖的TSB和YPD培養(yǎng)基，隨后加入該致病菌菌懸液各75 μL，再加入50 μL待測飲料，對照以無菌純凈水代替飲料，培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min，上清樣品經(jīng)硝酸消化后在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀下測定鈣離子濃度[13]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)分析使用Graphpad Prism 8.4.3，SPSS，R studio。使用One-way anova進行方差分析，P<0.05表示具有顯著性差異，使用R包pheatmap等進行聚類熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飲料的酸度和緩沖能力

本研究所選的飲料含糖量接近，但酸度相差較大，而飲料本身的酸度是重要的致齲因素，可以導(dǎo)致牙齒的酸蝕。pH值和緩沖容量是反映飲料的酸蝕能力的重要指標[14]。從圖1-a可知，果汁和碳酸飲料均具有較低的pH(<4)，而牛奶和礦泉水則呈現(xiàn)中性，pH為7左右，而酸奶由于本身黏度較高，無法直接測定，將其稀釋至原濃度1/10，其pH在4左右。飲料的緩沖能力是通過測量其緩沖容量來評價的，通常飲料中所含的酸式鹽使其具有一定的緩沖能力，通過測量緩沖容量即pH值改變1個單位所需的1 mol/L HCl的物質(zhì)的量可以反映飲料的緩沖能力。

a-飲料的初始pH；b-飲料的緩沖容量
圖1 飲料的酸蝕能力
Fig.1 Etching ability of beverages

從圖1-b可知，可樂的緩沖容量最強，可能具有最強的酸蝕能力，會增加齲齒的風(fēng)險。牛奶也具有較強的緩沖能力，牛奶蛋白質(zhì)含量豐富，且含有大量的鈣等無機鹽離子，使其具有良好的緩沖能力[14]。

2.2 不同飲料對雙菌生物膜形成的影響

牙菌斑生物膜的形成是齲病的始動因素，變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物膜的形成量是評價飲料致齲性的重要指標。由圖2可知，除酸奶外其他飲料的加入都使雙菌形成很強的生物膜，其OD600 nm>3。其中純牛奶使雙菌生物膜形成量最大，其OD600 nm達到3.47。牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，可以作為微生物優(yōu)良的氮源，且其pH為中性，適宜微生物旺盛生長，因而形成了較強的生物膜。牛奶富含營養(yǎng)，是兒童家長傾向于購買的飲料，但其致齲能力仍需要結(jié)合脫礦情況和體內(nèi)實驗以更好的評價。而果汁和碳酸飲料pH均為酸性，且雙菌生物膜形成量高，致齲性較強。相比之下，酸奶具有顯著的抑制生物膜形成的效果，這可能由于酸奶發(fā)酵過程中加入的乳桿菌具有調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)的作用，且不同于其他飲料當(dāng)中的檸檬酸，酸奶發(fā)酵過程產(chǎn)生的乳酸對致齲菌的生長可能起到了一定的抑制作用[15]，故形成的生物膜量最低。

圖2 飲料對雙菌生物膜形成的影響
Fig.2 Effect of beverages on the formation of double bacteria biofilm

2.3 不同飲料對雙菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

牙菌斑生物膜的形成與群體感應(yīng)信號分子的調(diào)控密切相關(guān)[16]，群體感應(yīng)是細菌根據(jù)細胞密度變化來調(diào)控基因表達的一種生理行為，其中存在于革蘭氏陰性菌和真菌中的基于AHL的信號分子[17]和廣泛存在于各微生物種間交流的AI-2的信號分子在微生物相互交流中起著重要作用[18]。群體感應(yīng)系統(tǒng)參與了大量基因表達的調(diào)控，包括發(fā)光效應(yīng)、生物膜形成、運動能力等多種表型[19]，通過群體感應(yīng)系統(tǒng)可以從另一個角度反映生物膜的形成。由圖3-a可知，雙菌的上清液中不存在AHL類物質(zhì)，沒有使紫色桿菌呈現(xiàn)紫色光圈。因此，后續(xù)實驗著重討論基于AI-2的群體感應(yīng)。

口腔復(fù)雜環(huán)境中通常為多菌共生，不同菌種間通過信號分子傳遞信息，相互調(diào)節(jié)[16]，AI-2作為一種種間信號分子在跨物種間的信息交流中具有重要的意義。哈維氏弧菌發(fā)光現(xiàn)象受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，我們選用了僅能響應(yīng)AI-2調(diào)控的哈維氏弧菌突變株BB170探究不同飲料的群體感應(yīng)現(xiàn)象，測定了不同飲料對雙菌群體感應(yīng)信號分子AI-2活性的影響。結(jié)果表明可樂、純牛奶、酸奶顯著促進了哈維氏弧菌的發(fā)光，即促進了雙菌間的AI-2分子的產(chǎn)生，而冰糖雪梨和橙汁則在一定程度上抑制了雙菌間的AI-2分子的產(chǎn)生。與圖2生物膜形成結(jié)果相對應(yīng)，大部分飲料生物膜的形成與群體感應(yīng)信號分子的產(chǎn)生呈正相關(guān)，有趣的是，酸奶抑制了雙菌生物膜形成，但并未抑制雙菌間的AI-2分子的產(chǎn)生，這表明酸奶對生物膜的抑制并非通過群體感應(yīng)途徑，可能通過其他調(diào)控機制進行。

a-雙菌的AHL檢測；b-飲料對雙菌產(chǎn)AI-2的影響
圖3 群體感應(yīng)檢測
Fig.3 Quorum sensing detection

2.4 不同飲料對雙菌產(chǎn)酸的影響

不同飲料使雙菌在培養(yǎng)過程中pH變化的程度不同。由圖4可知，加入飲料共培養(yǎng)后雙菌上清液有接近的pH值，但由于不同的飲料中含有酸的類型和濃度不同，對口腔致齲菌造成的影響不同，決定了飲料的致齲性。果汁中主要含檸檬酸和抗壞血酸，碳酸飲料主要含碳酸和檸檬酸，而酸奶主要含乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸。DELECRODE等[20]將志愿者口腔中獲得的牙本質(zhì)標本暴露在檸檬酸和乳酸中，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究共鑒定出223個不同的蛋白，其中檸檬酸顯著減少了耐酸蛋白如黏蛋白的含量，乳酸則沒有，而耐酸蛋白與牙齒穩(wěn)態(tài)保護作用有關(guān)，因此檸檬酸可能比乳酸具有更強的致齲性。碳酸飲料中的可樂本身具有最低的pH，在培養(yǎng)過后使雙菌產(chǎn)酸量更大，這表明，可樂具有極強的酸蝕能力且可以促進菌產(chǎn)酸，具有較強的致齲性。

圖4 雙菌在添加不同飲料培養(yǎng)后的pH
Fig.4 pH value of double-species culture after adding different drinks

2.5 不同飲料對羥基磷灰石鈣流失率的影響

齲齒的發(fā)生是牙齒脫礦的過程，脫礦過程會伴隨著鈣離子的流失。飲料的酸蝕性可能也會引起牙齒的脫礦，牙菌斑中的致齲菌本身會利用蔗糖產(chǎn)酸，其存在也將增加牙本質(zhì)的脫礦[21]。為探究飲料對致齲菌脫鈣的影響，用羥基磷灰石模擬牙齒，測定飲料與雙菌共培養(yǎng)后的脫鈣量。由圖5可知，可樂的脫鈣率顯著高于其他組，這也與圖1-b中反映飲料酸蝕能力的緩沖容量這一指標相吻合，酸蝕能力強則脫鈣較嚴重。

圖5 不同飲料對唾液包被羥基磷灰石鈣流失率的影響
Fig.5 Effect of different soft drinks on the loss rate of saliva-coated calcium hydroxyapatite

2.6 飲料的特性與致齲性聚類熱圖分析

齲齒的發(fā)生是多種因素共同導(dǎo)致的結(jié)果，為全面分析飲料對齲齒的影響，對上述測定的指標進行了聚類熱圖分析(圖6)。在圖6中，顏色越接近紅色，表明飲料對該特性的影響越強，顏色越接近藍色，表明飲料對該特性的影響越弱。從總體上看，碳酸飲料中的可樂和芬達具有較強的酸蝕能力和鈣流失率，引起齲齒的風(fēng)險更大；果汁飲料僅次于碳酸飲料，具有較強的促進雙菌生物膜形成的能力，本身也具有較低的pH，酸蝕能力較強；而純牛奶和水本身的pH接近中性，在與雙菌共培養(yǎng)過程中pH變化最為顯著，在體外牛奶也會促進生物膜形成，這可能由于其豐富的營養(yǎng)有利于微生物生長繁殖；而酸奶本身的pH較低，但卻可以顯著抑制生物膜的形成，鈣流失率也較低，不會促進齲齒的發(fā)生。

圖6 飲料的特性與致齲性聚類熱圖分析
Fig.6 Cluster analysis of beverage characteristics and cariogenicity

3 結(jié)論

本研究通過測定市售飲料酸度對變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物膜形成量的影響、對雙菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響，以及對羥基磷灰石脫礦程度的影響等指標來評價飲料對雙菌的致齲性影響，初步探究了不同飲料的致齲性，對于同類型的飲料，雖pH接近但對雙菌致齲性影響也有差異，其中可樂酸蝕能力強且造成牙齒鈣流失率高。本研究為將來繼續(xù)深入分析飲料的致齲性提供了一定的理論指導(dǎo)，也為兒童飲料的選擇提供了參考。