白酸湯發(fā)酵過程中微生物多樣性及有機(jī)酸動(dòng)態(tài)變化研究

白酸湯是以大米、糯米為原料，由醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物發(fā)酵而成的傳統(tǒng)調(diào)味品，具有酸鮮純正、清涼爽口的獨(dú)特風(fēng)味，在西南地區(qū)廣受歡迎[1]，有悠久的食用歷史。白酸湯含有豐富的益生菌、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、維生素等物質(zhì)，對(duì)降低腸道pH、促進(jìn)人體利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抑制致病菌生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防消化道疾病等有重要作用[2-5]。然而長(zhǎng)期以來，白酸湯大都是小作坊生產(chǎn)，為數(shù)不多的酸湯企業(yè)采用的也都是傳統(tǒng)自然發(fā)酵，生產(chǎn)規(guī)模小、發(fā)酵周期長(zhǎng)、受環(huán)境影響大、酸湯質(zhì)量不穩(wěn)定，嚴(yán)重限制了白酸湯大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[6]。

近幾年，關(guān)于白酸湯中微生物群落和有機(jī)酸組成的研究越來越多，但對(duì)其相關(guān)性分析的文獻(xiàn)極少。熊瑛等[7]對(duì)貴州5個(gè)不同地區(qū)酸湯中的有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)乳酸占總酸70%以上，其次為乙酸、檸檬酸。石敏等[8]通過傳統(tǒng)分離、計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)凱里白酸湯中優(yōu)勢(shì)微生物有乳桿菌、明串珠菌和醋酸桿菌。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，宏基因技術(shù)越來越多的被應(yīng)用于發(fā)酵食品中，發(fā)酵食品中復(fù)雜的微生物群落組成、變化以及功能被越來越多的學(xué)者關(guān)注[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)白酸湯發(fā)酵過程中微生物群落組成進(jìn)行分析，同時(shí)通過高效液相色譜法測(cè)定其有機(jī)酸含量，并采用雙向正交偏最小二乘法(orthogonal function partial least squares，O2PLS)對(duì)微生物群落變化和有機(jī)酸含量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，確定與有機(jī)酸含量相關(guān)性高的微生物種類。為進(jìn)一步篩選、分離白酸湯中優(yōu)勢(shì)微生物菌種，為直投式發(fā)酵劑研發(fā)，實(shí)現(xiàn)白酸湯發(fā)酵過程的精準(zhǔn)調(diào)控，提高白酸湯產(chǎn)品生產(chǎn)效率與品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老酸湯，貴州亮歡寨生物科技有限公司；安琪甜酒曲，安琪酵母股份有限公司；糯米粉，市售；甲醇，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆换钚蕴?，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；磷酸、乳酸、蘋果酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸，成都金山化學(xué)試劑有限公司；丁二酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器設(shè)備

LDZM-60L型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-150BⅢ型生化培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白酸湯制作工藝流程及操作要點(diǎn)

原料→煮沸→冷卻→液化→滅菌→冷卻→接種老酸湯→36 ℃恒溫培養(yǎng)→白酸湯

操作要點(diǎn)：原料中糯米粉和水的料液比為1∶50(g∶mL)；安琪甜酒曲添加量為0.4%；老酸湯接種量為10%；每24 h取樣，-18 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 有機(jī)酸測(cè)定

采用高效液相色譜法[7]，稱取酸湯樣品10 g，加入活性炭0.2 g，純凈水定容至50 mL，振蕩混勻，5 000 r/min離心10 min，上清液0.22 μm水系濾膜過濾，測(cè)定乳酸、乙酸、蘋果酸和丁二酸含量。

1.3.3 微生物多樣性測(cè)定

將所采集樣本送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)定處理。具體測(cè)定流程為：微生物總DNA提取，對(duì)細(xì)菌基因組V3～V4區(qū)使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、反向引物806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，真菌ITS區(qū)使用正向引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、反向引物ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增[11-13]，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，熒光定量處理，在Illumina MiSeq平臺(tái)上對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

數(shù)據(jù)處理與分析：使用SMRT Link軟件，將所有的subreads進(jìn)行相互比對(duì)和質(zhì)量校正，自我糾錯(cuò)后得到高質(zhì)量的一致性序列CCS reads，根據(jù)雙端barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)。然后將其進(jìn)行聚類，其中相似性≥97%的序列歸為1個(gè)OTU，將OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫[14]進(jìn)行比對(duì)和物種注釋，最后對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs豐度、Alpha和Beta多樣性等分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

分別采用系統(tǒng)軟件SPSS和SIMCA-p進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酸湯發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化

在白酸湯發(fā)酵過程中，有機(jī)酸總量呈逐漸上升的趨勢(shì)，如圖1所示，6 d后有機(jī)酸含量保持不變，說明此時(shí)白酸湯發(fā)酵基本結(jié)束。其中乳酸和乙酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間增加而穩(wěn)定增長(zhǎng)，在第6天均達(dá)最大值，分別為5.58和1.04 mg/mL；蘋果酸含量先降后增，在第0天時(shí)為0.17 mg/mL，第3天降至0.09 mg/mL，4～6 d逐漸增長(zhǎng)，最終含量為0.19 mg/mL；丁二酸在0～3 d時(shí)未檢出，4～6 d隨發(fā)酵時(shí)間呈直線上升，在第6天達(dá)到最高為0.33 mg/mL。乳酸和乙酸含量在白酸湯發(fā)酵過程中占有機(jī)酸總含量的95%以上，是白酸湯中主要有機(jī)酸。

圖1 白酸湯發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化
Fig.1 Changes of organic acid content during fermentation of white acid soup

2.2 白酸湯發(fā)酵過程中微生物變化

2.2.1 白酸湯發(fā)酵過程中微生物的α多樣性分析

Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可以用來評(píng)價(jià)菌群豐富度[15]，如表1所示，在白酸湯發(fā)酵過程中，細(xì)菌的物種豐富度呈先升高后降低的趨勢(shì)，Ace指數(shù)在第3天時(shí)最高為111，比第0天增長(zhǎng)了81.97%，在第8天時(shí)降至0；Chao指數(shù)在第5天時(shí)最高為129，比第0天增長(zhǎng)了111.48%，在第8天時(shí)降低至63。真菌物種豐富度隨發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)而持續(xù)降低，在第0天時(shí) Chao指數(shù)和Ace指數(shù)為50.07和49.75，在第8天時(shí)為38.13和37.75，分別降低了23.85%和24.12%。

菌群多樣性通過Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來評(píng)價(jià)[16]。細(xì)菌物種多樣性隨發(fā)酵時(shí)間的變化也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，Simpson指數(shù)變化不明顯，Shannon指數(shù)在第5天達(dá)到最大為4.73，后持續(xù)減小，第8天時(shí)降至3.81。Shannon指數(shù)顯示真菌物種多樣性在第0天時(shí)最高為1.77，后持續(xù)降低至0.87。Simpson指數(shù)顯示真菌物種多樣性在第4天時(shí)最高為0.46，比第0 天增長(zhǎng)了109.09%。

細(xì)菌的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)及Shannon指數(shù)均大于真菌，說明細(xì)菌菌群豐富度和物種多樣性均大于真菌，由此可見細(xì)菌在白酸湯發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用更大。石敏等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)，白酸湯在發(fā)酵1～4 d有效酸度和總酸含量持續(xù)增加，總糖含量持續(xù)降低，在第5天后趨于平緩。本實(shí)驗(yàn)中，在白酸湯發(fā)酵5 d時(shí)，物種豐富度及多樣性最高，微生物大量繁殖，推測(cè)是米湯中營(yíng)養(yǎng)成分被快速消耗，后續(xù)無法滿足更多菌群的生長(zhǎng)需求，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)受到抑制。

表1 發(fā)酵過程中的微生物α多樣性分析
Table 1 Analysis of microbial α diversity during fermentation

2.2.2 白酸湯發(fā)酵過程中微生物β多樣性分析

對(duì)發(fā)酵不同時(shí)間的白酸湯進(jìn)行種水平上的層級(jí)聚類分析，探究發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖2所示。

a-細(xì)菌；b-真菌
圖2 白酸湯發(fā)酵過程中種水平上的層級(jí)聚類
Fig.2 Hierarchical clustering on species level in the fermentation of white sour soup

樣品之間越接近，其種水平上的結(jié)構(gòu)就越相似，3～6 d，7～8 d 和 0～2 d 的細(xì)菌菌群分為3簇，有明顯差異性。0、4、6～8 d 的真菌菌群也分為3簇且差異性顯著。由此說明，白酸湯發(fā)酵主要經(jīng)歷前(0～2 d)、中(3～6 d)、后(6～8 d)3個(gè)階段，且這3個(gè)階段微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。發(fā)酵前期，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群為維氏乳桿菌(Lactobacillus vini)和羅旺醋桿菌(Acetobacter lovaniensis)，真菌物種多樣性在此期間最高，優(yōu)勢(shì)菌群有毛榛畢赤酵母(Pichia mandshurica)、桔假絲酵母(Candida quercitrusa)和矮小假絲酵母(Kazachstania humilis)。發(fā)酵中期，細(xì)菌物種多樣性最高，優(yōu)勢(shì)菌群為法式醋酸桿菌(Acetobacter farinalis)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、類谷糠乳桿菌(Lactobacillus parafarraginis)和液化葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter liquefaciens)，真菌優(yōu)勢(shì)菌群為毛榛畢赤酵母。發(fā)酵后期，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群為維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌，真菌優(yōu)勢(shì)菌群為毛榛畢赤酵母。

2.2.3 群落結(jié)構(gòu)組分分析

如圖3所示，白酸湯中細(xì)菌組成在種水平上主要有維氏乳桿菌(Lactobacillus vini)、法式醋酸桿菌(Acetobacter farinalis)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、羅旺醋桿菌(Acetobacter lovaniensis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus)等12種菌種。發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)菌群為維氏乳桿菌和羅旺醋桿菌，其豐度分別為41.66%、23.53%，維氏乳桿菌比第0天增長(zhǎng)了314.11%。法式醋酸桿菌和布氏乳桿菌是發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌群，其豐度分別達(dá)到25.08%和32.16%，類谷糠乳桿菌(Lactobacillus parafarraginis)和液化葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter liquefaciens)在此期間豐度也達(dá)到最大分別為10.8%和10.5%。發(fā)酵后期維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌的豐度達(dá)到80%，說明在發(fā)酵后期維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌起主導(dǎo)作用。

白酸湯中真菌的物種多樣性比細(xì)菌少，在種水平上主要有毛榛畢赤酵母(Pichia mandshurica)、桔假絲酵母(Candida quercitrusa)、矮小假絲酵母(Kazachstania humilis)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)、Zygoascus meyerae、三角酵母(Trigonopsis variabilis)。白酸湯第0天優(yōu)勢(shì)菌群為毛榛畢赤酵母、桔假絲酵母、矮小假絲酵母，其占比分別為12.4%、20.2%、14.8%，發(fā)酵過程中，毛榛畢赤酵母迅速繁殖成為發(fā)酵中后期優(yōu)勢(shì)菌群，在第8天時(shí)豐度達(dá)到77.9%。三角酵母相對(duì)豐度也由0.04%增長(zhǎng)至1.08%。其他酵母生長(zhǎng)均被抑制。

a-細(xì)菌；b-真菌
圖3 白酸湯發(fā)酵過程中種水平細(xì)菌及真菌相對(duì)豐度變化
Fig.3 Changes of relative abundance of bacteria and fungi at species level during fermentation of white sour soup

王琪琪等[17]研究結(jié)果表明：白酸湯中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為哈氏乳桿菌(Lactobacillus harbinensis,43.46%)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri,31.25%)等，優(yōu)勢(shì)真菌為膜璞畢赤酵母(Pichia membranifaciens,88.31%)和博伊丁假絲酵母(Candida boidinii,6.39%)。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，在屬水平上一致，在種水平上有明顯差異，可見白酸湯發(fā)酵菌種的多樣性。白酸湯是以大米、糯米為原料，由醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物發(fā)酵而成，但是不同公司的白酸湯主要發(fā)酵菌種不一致，這可能是導(dǎo)致市售白酸湯風(fēng)味不統(tǒng)一的重要原因。

2.2.4 有機(jī)酸及優(yōu)勢(shì)菌群相關(guān)性分析

2.2.4.1 白酸湯發(fā)酵過程與有機(jī)酸相關(guān)的微生物重要性指標(biāo)分析

利用O2PLS[18]模型對(duì)細(xì)菌和真菌相對(duì)豐度與有機(jī)酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得菌群豐度與有機(jī)酸含量相關(guān)性的自變量重要性指標(biāo)[變量投影重要性(variable importance projection，VIP)(pred)]。如圖4所示，細(xì)菌和真菌的VIP(pred)均在0.5～1.5。大于1.4的有2個(gè)種，在1.3～1.4的有4個(gè)種，在1.2～1.3的有2個(gè)種，在1.0～1.2的有7個(gè)種。其中法式醋酸桿菌、維氏乳酸桿菌與有機(jī)酸相關(guān)重要性最高，選VIP(pred)值>1的15個(gè)種進(jìn)行與有機(jī)酸相關(guān)的分析。

圖4 與有機(jī)酸相關(guān)的微生物VIP分析
Fig.4 Microbial VIP analysis related to organic acids

圖5 微生物與有機(jī)酸相關(guān)性系數(shù)熱圖
Fig.5 Correlation coefficient heatmap of microorganisms and organic acids 注：*代表微生物與有機(jī)酸之間差異顯著(P<0.05)； **代表差異極顯著(P<0.01)

2.2.4.2 白酸湯發(fā)酵過程與有機(jī)酸相關(guān)微生物分析

選取VIP(pred)值>1的細(xì)菌和真菌(種)與有機(jī)酸進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5所示。

與乳酸呈正相關(guān)的有9個(gè)種，負(fù)相關(guān)9個(gè)種，維氏乳桿菌與乳酸含量極顯著正相關(guān)(P<0.01)；與乙酸正相關(guān)的有10個(gè)種，負(fù)相關(guān)有8個(gè)種，法式醋酸桿菌與乙酸含量極顯著正相關(guān)(P<0.01)；與蘋果酸正相關(guān)的有9個(gè)種，負(fù)相關(guān)9個(gè)種，解淀粉乳桿菌與蘋果酸含量顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；與丁二酸正相關(guān)的有8個(gè)種，負(fù)相關(guān)10個(gè)種，三角酵母與丁二酸含量顯著正相關(guān)(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)采用靜置發(fā)酵，因此：發(fā)酵初期，發(fā)酵液中可能積累了米湯液化后的糖類物質(zhì)，維氏乳桿菌經(jīng)過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，因此維氏乳桿菌和乳酸極顯著正相關(guān)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，布氏乳桿菌經(jīng)過異型發(fā)酵將乳酸轉(zhuǎn)化乙酸和乙醇[19]，因此布氏乳桿菌和乳酸顯著負(fù)相關(guān)，與乙酸正相關(guān)。發(fā)酵中后期，由于乙醇的產(chǎn)生和發(fā)酵液酸度的降低等原因維氏乳桿菌、布氏乳桿菌等乳桿菌生長(zhǎng)受到抑制，法式醋酸桿菌、羅旺醋酸桿菌大量繁殖，乙酸累積，因此醋酸桿菌與乙酸顯著正相關(guān)。蘋果酸和丁二酸為三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物，在產(chǎn)生的同時(shí)又作為其他代謝途徑的原料被消耗，所以沒有大量累積。酵母菌在發(fā)酵過程中能代謝產(chǎn)生氨基酸、酶、乙醇等物質(zhì)，為其他微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源[20]，毛榛畢赤酵母含量和乳酸、乙酸含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，三角酵母和丁二酸含量也呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

白酸湯產(chǎn)品在西南地區(qū)廣受歡迎，但其發(fā)酵機(jī)理和發(fā)酵工藝尚不明確，生產(chǎn)模式也尚未統(tǒng)一。因此，探索白酸湯發(fā)酵過程中微生物的多樣性及有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、分離優(yōu)勢(shì)菌株、開發(fā)人工可控發(fā)酵白酸湯，具有十分重要的理論意義和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

通過高通量測(cè)序技術(shù)和高效液相色譜法對(duì)白酸湯發(fā)酵不同時(shí)期樣品的微生物多樣性和有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定，并利用雙向正交偏最小二乘法(O2PLS)對(duì)微生物相對(duì)豐度與有機(jī)酸含量相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，白酸湯發(fā)酵過程中微生物種類豐富，細(xì)菌的生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌生物多樣性。通過在種水平分析細(xì)菌和真菌在發(fā)酵過程中的種類和豐度，并與有機(jī)酸含量相關(guān)性進(jìn)行分析推測(cè)，發(fā)酵前期，維氏乳桿菌能迅速適應(yīng)新環(huán)境，大量繁殖，豐度達(dá)到41.66%，主要發(fā)酵產(chǎn)物乳酸降低了酸湯中pH，同時(shí)還參與發(fā)酵過程中氨基酸代謝[21-22]，豐富了產(chǎn)品風(fēng)味。毛榛畢赤酵母和桔假絲酵母生長(zhǎng)良好，它們能夠參與碳水化合物代謝和酯類物質(zhì)形成，對(duì)產(chǎn)品的香氣和風(fēng)味有重要作用[23]，桔假絲酵母可以通過Ehrlich途徑代謝產(chǎn)生氨基酸小分子，比其他酵母產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)更多[24]。發(fā)酵中期，經(jīng)過前期乳酸發(fā)酵和乙醇發(fā)酵后，酸度的降低和乙醇、乳酸的積累為法式醋酸桿菌和布氏乳桿菌的生長(zhǎng)提供了適宜的碳源和環(huán)境，其豐度分別達(dá)到 25.08%和32.16%，積累一定量的乙酸。類谷糠乳桿菌和液化葡糖酸醋酸桿菌在此期間豐度達(dá)到最大分別為10.8%和10.5%，類谷糠乳桿菌的代謝產(chǎn)物能夠抑制致病菌和腐敗酵母菌的生長(zhǎng)[25]，液化葡糖酸醋酸桿菌有多種酶類，可產(chǎn)生多種影響發(fā)酵過程中抗氧化性能變化的重要化合物[26]。發(fā)酵后期，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，白酸湯中營(yíng)養(yǎng)成分消耗以及pH值持續(xù)下降，許多不耐酸細(xì)菌和真菌受到抑制，經(jīng)過白酸湯環(huán)境的多重選擇，白酸湯中微生物趨于穩(wěn)定，維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌的豐度達(dá)到80%，毛榛畢赤酵母豐度達(dá)到77.9%，說明在白酸湯發(fā)酵后期維氏乳桿菌、法式醋酸桿菌和毛榛畢赤酵母起主導(dǎo)作用。

綜上所述，本研究揭示了白酸湯發(fā)酵過程中與有機(jī)酸含量相關(guān)性較高的功能微生物為維氏乳桿菌、法式醋酸桿菌和毛榛畢赤酵母，為進(jìn)一步篩選、分離白酸湯中優(yōu)勢(shì)微生物菌種，研發(fā)直投式發(fā)酵劑，為實(shí)現(xiàn)白酸湯發(fā)酵過程的精準(zhǔn)調(diào)控，提升白酸湯品質(zhì)穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。