黑果腺肋花楸果微乳系統薄層色譜分析及生物自顯影抗氧化活性研究

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott)，又稱不老莓，最早起源于北美東北部，20世紀90年代引入我國，在食用、藥用、園林、生態(tài)方面均應用廣泛[1]，2018年9月國家衛(wèi)健委正式批準黑果腺肋花楸果為新食品原料[2]。黑果腺肋花楸果實中主要化學成分為原花青素、花色苷、黃酮、酚酸等[3]，據報道黑果腺肋花楸果實中花青素、黃酮、多酚含量遠超其他漿果，甚至是已知植物中含量最高的[4]。近年來發(fā)現黑果腺肋花楸果實及提取物在抗氧化、抗突變、抗炎、抗腫瘤，抗糖尿病以及防治心血管疾病等方面都有顯著作用[5-8]。

已有文獻報道了采用pH示差法[9]，高效液相色譜[10]測定黑果腺肋花楸果中花色苷含量；紫外可見分光光度法[11]測定總黃酮含量；Folin-Ciocalteu法[12]測定酚酸類成分，但是到目前為止，還未見高效薄層色譜法同時測定黑果腺肋花楸果中花色苷、黃酮、酚酸類成分的報道。

微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相按適當比例自發(fā)生成的有增溶作用的熱力學穩(wěn)定體系[13]，以微乳液為展開劑進行的薄層色譜分析稱為微乳色譜，目前已應用于黃酮、皂苷、生物堿和多糖類等成分的分離鑒定[14]。聚酰胺分子中的酰胺鍵可與酚類、酸類、醌類等化合物形成氫鍵締合而產生吸附解析，因此聚酰胺薄膜已成為黃酮類、酚類、有機酸、生物堿類等薄層分析方法中的常用固定相[15]。本研究在前期實驗中考察了傳統硅膠薄層色譜和聚酰胺薄膜結合微乳系統薄層色譜，發(fā)現聚酰胺薄膜結合微乳系統薄層色譜比傳統硅膠薄層色譜靈敏度和分離效率要高，重現性好。因此本研究采用聚酰胺-微乳薄層系統結合高效薄層色譜法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)，測定黑果腺肋花楸果中多種成分含量，通過紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visible spectroscopy, UV-Vis)測定其對DPPH自由基的清除能力，通過薄層生物自顯影技術判定抗氧化活性成分。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

半自動點樣儀、SCANNER 3型薄層色譜掃描儀、薄層色譜數碼成像系統，瑞士CAMAG；超聲波清洗儀(150 W，40 kHz)，昆山市超聲儀器有限公司；萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

黑果腺肋花楸果凍干粉，經鑒定為薔薇科腺肋花楸屬植物黑果腺肋花楸的果實，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，C3G)、金絲桃苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷(cyanidin-3-O-arabinofuranoside，C3A)，北京索萊寶科技有限公司；綠原酸、新綠原酸、維生素C，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼，梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；其余實驗所用試劑均為分析純。

1.3 薄層掃描方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 C3G、金絲桃苷、綠原酸對照品溶液的制備

精密稱取C3G、金絲桃苷及綠原酸對照品適量，加甲醇定容至容量瓶中，配成C3G、金絲桃苷、綠原酸系列質量濃度分別為89.42、149.04、248.40、414.00、690.00 μg/mL；5.42、9.03、15.05、25.08、41.80 μg/mL；25.79、42.98、71.64、119.40、199.00 μg/mL的混合溶液，搖勻后經0.22 μm濾膜過濾后作為對照品溶液。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

稱取黑果腺肋花楸果凍干粉1.00 g，置棕色容量瓶中，以60%甲醇(經0.5% HCl調節(jié)pH至2～3)為溶劑，料液比1∶10(g∶mL)，40 ℃條件下超聲提取30 min，冷卻至室溫后過濾，濾液經0.22 μm濾膜過濾后作為供試品溶液。

1.3.2 色譜程序

使用CAMAG Linomat 5半自動斑點采樣器，對聚酰胺薄膜條狀點樣，采樣器的載氣為N2，釋放速率為150 nL/s，對照品與供試品溶液均為2 μL，帶長6 mm，軌道距離8 mm，左右邊距50 mm，條帶間距9 mm。以質量分數75%含水量微乳-甲酸(9∶1，mL∶mL)為展開劑，在展開缸中飽和10 min后展開，取出，晾干，花色苷類成分在白光下檢視，黃酮類，酚酸類成分先噴2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)甲醇溶液，后噴聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)400甲醇溶液，105 ℃加熱后置于366 nm紫外燈下檢視。使用Reprostar 3薄層色譜儀分別在白光和366 nm紫外燈下檢查和捕獲樣品圖像。使用CAMAG TLC 3掃描儀對對照品和樣品進行全波長掃描，距底部的擴展距離為90和8 mm，狹縫寬度為6 mm×0.3 mm，掃描速度為20 mm/s。用WinCATS4.04版本TLC在350和550 nm下掃描該聚酰胺薄膜，狹縫寬度為4 mm×0.3 mm，掃描速度為20 mm/s。

1.3.3 方法學考察

對建立的聚酰胺結合微乳系統薄層色譜方法進行方法學考察，包括線性、日內、日間精密度、穩(wěn)定性、重復性、耐用性、回收率。

1.3.4 含量測定

對不同批次黑果腺肋花楸果凍干粉樣品中C3G、金絲桃苷及綠原酸進行含量測定。

1.4 UV-Vis法測定總抗氧化活性

1.4.1 溶液的制備

1.4.1.1 維生素C對照品溶液的制備

稱取維生素C對照品6.54 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇配成質量濃度為0.654 mg/mL的對照品溶液。經適當稀釋分別配成6.54、13.08、19.62、26.16、39.24、52.32、65.40 μg/mL的溶液。

1.4.1.2 供試品溶液的制備

根據實驗需要將1.3.1.2中供試品溶液經稀釋配成質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的供試品溶液。

1.4.1.3 DPPH溶液的制備

稱取DPPH對照品4.52 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇配成質量濃度為0.045 2 mg/mL的溶液。

1.4.2 DPPH自由基清除率測定

吸取3 mL DPPH溶液與1 mL甲醇混勻后，在最大吸收波長516 nm處測定吸光度A0；吸取DPPH溶液3 mL加入系列對照品或供試品溶液1 mL混勻，避光反應0.5 h后，在516 nm處測定吸光度Ai；空白為甲醇3 mL與相對應系列對照品或供試品溶液1 mL混勻，避光反應0.5 h后在516 nm處測定吸光度Aj，按公式(1)計算清除率(S)。

(1)

1.5 薄層生物自顯影(TLC Biography,TLC-Bio)分析黑果腺肋花楸果提取物中抗氧化活性成分

1.5.1 溶液的制備

精密稱取C3A，新綠原酸對照品適量，加甲醇配成質量濃度為0.2、0.263 mg/mL對照品溶液。

1.5.2 TLC-Bio測定黑果腺肋花楸果提取物中抗氧化活性成分

分別吸取C3G、C3A、新綠原酸、金絲桃苷、綠原酸混合對照品溶液，黑果腺肋花楸供試品溶液各2 μL，按1.3.2方法操作，點樣于a，b兩張聚酰胺薄膜后，展開取出，晾干，不進行掃描。將聚酰胺薄膜a先在白光下檢視，再噴顯色劑，先噴2-APB，后噴PEG400，晾干后置紫外366 nm光下檢視，聚酰胺薄膜b晾干后直接噴DPPH甲醇溶液，直到呈現紫色背景，在白光下檢視。

2 結果與分析

2.1 薄層掃描最大吸收波長的確定

掃描儀對對照品和供試品進行掃描后發(fā)現黑果腺肋花楸果供試品溶液斑點與對照品斑點比移值相同，光譜圖最大吸收波長一致(圖1)，C3G為550 nm，綠原酸為340 nm，金絲桃苷為370 nm，且波形一致，可以認為是同一物質。綠原酸與金絲桃苷在350 nm處均有較大吸收，后續(xù)實驗采用雙波長法分別在350、550 nm處對綠原酸，金絲桃苷和C3G進行分析。

a-C3G；b-金絲桃苷；c-綠原酸
圖1 最大吸收光譜和化學結構圖
Fig.1 The maximum absorption spectrum and chemical structure

2.2 方法學結果

2.2.1 線性

分別吸取1.3.1.1中C3G、金絲桃苷及綠原酸系列濃度對照品溶液，按1.3.2方法操作，以濃度為x軸，峰面積為y軸，得到對照品C3G，金絲桃苷，綠原酸的線性回歸方程，見表1。

表1 方法的線性關系考察表
Table 1 Method of linear relation investigation table

2.2.2 日內間精密度

分別吸取C3G、金絲桃苷及綠原酸的低、中、高濃度對照品溶液，各重復3次點于聚酰胺薄膜上，按1.3.2方法操作，測定C3G、金絲桃苷、綠原酸峰面積計算日內間精密度，以相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)表示。日內和日間精密度的RSD值如表2所示，結果表明精密度良好。

表2 日內、日間精密度考察表
Table 2 Intraday and inter-day precision investigation table

2.2.3 穩(wěn)定性

按1.3.2方法操作，吸取混合對照品溶液點樣(n=6)于同一聚酰胺薄膜上，分別記錄C3G、金絲桃苷、綠原酸在0、2、4、6、8、12、24 h內峰面積并計算RSD，見表3，結果表明穩(wěn)定性良好，C3G、金絲桃苷、綠原酸RSD均<3%。

表3 穩(wěn)定性試驗結果
Table 3 Stability test results

2.2.4 重復性

按1.3.1.2提取同一批黑果腺肋花楸凍干果粉溶液(n=6)，按1.3.2方法操作，記錄供試品中C3G、金絲桃苷、綠原酸峰面積，經計算RSD均<3%，重復性試驗符合要求(表4)。

表4 重復性試驗結果
Table 4 Repeatability test results

2.2.5 耐用性

按1.3.2方法操作，改變試驗條件包括流動相比例(±0.1 mL)、飽和時間(±2 min)、掃描波長(±2 nm)，記錄峰面積標準偏差(standard deviation，SD)和RSD。通過對展開劑比例、飽和時間、掃描波長進行輕微變動考察發(fā)現RSD均<3%，結果見表5。

表5 耐用性試驗結果
Table 5 Durability test results

2.2.6 回收率

分別吸取供試品溶液適量，加入相當于C3G、金絲桃苷、綠原酸0.263、0.105 5、0.568 mg的對照品溶液，混合均勻。按1.3.2方法操作，結果見表6，C3G、金絲桃苷、綠原酸平均回收率分別為100.6%、100.0%、99.4%；RSD分別為3.4%、2.6%、2.9%，表明該方法回收率良好。

表6 回收率試驗結果
Table 6 Recovery test results

2.3 含量測定

按1.3.1.2制備不同批號黑果腺肋花楸凍干果粉溶液(n=3)，吸取4批供試品溶液點于同一聚酰胺薄膜上，通過對比對照品C3G、金絲桃苷和綠原酸與樣品中相應斑點的Rf值(分別為0.42、0.33、0.51)確定供試品中相應峰，采用外標法測定4批供試品中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量(圖2、表7)。

S-混標：A-C3G；B-綠原酸；C-金絲桃苷； S1～S4：四批黑果腺肋花楸果
圖2 四批黑果腺肋花楸果薄層色譜圖
Fig.2 Thin-layer chromatogram of four batches of black chokeberry

表7 樣品含量測定結果 單位：mg/g

Table 7 Results of sample content determination

2.4 DPPH自由基清除率結果

2.4.1 不同濃度維生素C對DPPH自由基的清除率

由表8可知，維生素C清除50%DPPH自由基質量濃度約在14 μg/mL，從圖3看出維生素C對DPPH自由基的清除能力與濃度相關，一定范圍內DPPH自由基清除率隨維生素C濃度增加而增大。文獻也多用此方法測定抗氧化能力，一定程度上表明本方法測定抗氧化能力是可行的。

2.4.2 不同濃度黑果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除率

由表9可知，黑果腺肋花楸果提取物濃度約為0.18 mg/mL能清除50%的DPPH自由基，從圖4可看出，清除率隨黑果腺肋花楸果提取物濃度增大而增加，濃度達1.2 mg/mL時，清除率為95.90%。

表8 維生素C對DPPH清除結果
Table 8 The DPPH scavenging rate of vitamin C

圖3 維生素C對DPPH自由基的清除曲線
Fig.3 The Vc scavenging ability toward DPPH

表9 黑果腺肋花楸果對DPPH清除結果
Table 9 The DPPH scavenging rate of black chokeberry

圖4 黑果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除曲線
Fig.4 Scavenging ability of black chokeberry toward DPPH

2.5 TLC-Bio分析黑果腺肋花楸的抗氧化活性成分

由圖5可知，薄層板無抗氧化活性，呈紫色背景，而對照品和供試品顯現黃白色斑點，顯示具有良好的抗氧化活性，說明黑果腺肋花楸中C3G、C3A、金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸都有不同程度的抗氧化活性，除此之外供試品中還含有其他未知抗氧化活性成分，有待于進一步分離鑒定。

a-普通色譜圖(Ⅰ白光；Ⅱ 紫外366nm)；b-生物自顯影色譜圖 A-C3G；B-C3A；C-新綠原酸；D-綠原酸；E-金絲桃苷
圖5 生物自顯影色譜圖
Fig.5 TLC-Bio chromatograms

3 結論與討論

文獻報道了黑果腺肋花楸果富含花色苷、黃酮、酚酸類成分，前期實驗先采用硅膠薄層色譜與聚酰胺-微乳薄層色譜鑒別指認了其中含有C3G、金絲桃苷、綠原酸、蘆丁，發(fā)現聚酰胺-微乳薄層色譜斑點清晰，分離度高，因此本研究采用聚酰胺-微乳薄層系統結合高效薄層色譜建立同時測定黑果腺肋花楸果實中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量的方法，4批黑果腺肋花楸果粉中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量分別在2.028～3.886，0.092～0.155和0.653～1.058 mg/g，該方法樣品制備簡單，對所得數據進行統計分析，證明該方法重復性好、選擇性強，可作為一個簡單、快速的半定量方法。

UV-Vis法測定了黑果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除率，當黑果腺肋花楸果凍干粉經超聲醇提，按干重計算質量濃度約為0.18 mg/mL時可清除50%DPPH自由基，當提取物質量濃度達到1.2 mg/mL時，清除率可達95.90%，文獻中報道的樹莓醇提物、黑果小檗提取物、黑果枸杞水提物的IC50分別約為1.00、0.26、0.42 mg/mL[16-18]，桑葚、藍莓、黑加侖IC50分別約為0.95、8.91、8.11 mg/mL[19]，作為新食品原料，對于漿果類來說黑果腺肋花楸果對DPPH自由基清除能力強。經薄層生物自顯影技術初步確定黑果腺肋花楸果實中C3A、C3G、金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸均具抗氧化活性，除此之外還存在其他未知抗氧化活性成分，有待于進一步分離鑒定。

值得注意的是黑果腺肋花楸果中含有新綠原酸，從薄層色譜圖中看到新綠原酸斑點顏色較深，與綠原酸斑點顏色相近，新綠原酸與綠原酸是同分異構體，認為對儀器響應值一致，因此認為含量水平相當。新綠原酸除具有抗炎、抗氧化、抗癌[20-22]等活性外，還對醛糖還原酶[23]，流感病毒神經氨酸酶[24]等具抑制作用，可用于糖尿病慢性并發(fā)癥以及流感等疾病的防治。

本研究采用黑果腺肋花楸果凍干粉，真實反映了鮮果中的活性成分，鑒于黑果腺肋花楸果具較好的生物活性，除了在生態(tài)方面，其在飲料、食品、藥品、醫(yī)療保健品等方面都具有較大的開發(fā)潛力和應用價值。