剛果紅法定量檢測酵母β-葡聚糖的方法研究
酵母細胞壁來源的β-葡聚糖(yeast β-glucan, Y β-Glu)分為堿溶性和堿不溶性,堿不溶性酵母β-葡聚糖具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、改善腸道菌群[3]、提高人體免疫力等作用,在疾病的預(yù)防、治療方面有著潛在的應(yīng)用價值。酵母β-葡聚糖也是一種大分子物質(zhì),具有β-1,3鍵構(gòu)成的主鏈,以及β-1,6鍵形成的分支,并具有獨特的三螺旋空間結(jié)構(gòu)[4],不溶于水、酸、堿。
剛果紅(Congo red,CR)是一種陰離子偶氮染料,棕紅色、粉狀,易溶于水,具有聯(lián)苯偶氮結(jié)構(gòu),能與酵母β-葡聚糖三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性結(jié)合[5]。有研究表明,酵母β-葡聚糖中每1個3鏈6螺旋片段中可容納1分子的剛果紅,兩者之間可通過氫鍵和疏水鍵結(jié)合,形成穩(wěn)定的紅色復(fù)合物[6-7],并使復(fù)合物在可見光區(qū)的最大吸收波長發(fā)生紅移[8-9]。根據(jù)此性質(zhì)可定量檢測酵母β-葡聚糖的含量。
酵母β-葡聚糖檢測方法有苯酚-硫酸法[10]、酶法[11]等,這些方法都是將多糖分解成葡萄糖分子,然后再換算為β-葡聚糖,忽略了其他多糖雜質(zhì)的影響,檢測結(jié)果特異性不好,誤差偏大,在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中具有一定的局限性。NITSCHKE等[9]建立了剛果紅試劑用于檢測具有β-1,3-1,6結(jié)構(gòu)的可溶性蘑菇多糖的方法,為具有相似結(jié)構(gòu)的酵母β-葡聚糖的檢測提供了借鑒,但酵母β-葡聚糖的不溶性,卻妨礙了該方法的直接應(yīng)用。王志等[12]利用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作為酵母β-葡聚糖的助溶劑,實現(xiàn)了酵母β-葡聚糖溶解,剛果紅試劑得以用于酵母β-葡聚糖檢測,并建立了相應(yīng)的檢測體系。但是該方法沒有對檢測的特異性進行研究,不能排除酵母細胞壁中堿溶性β-1,3葡聚糖的干擾,該文報道的可完全溶解β-葡聚糖的最低DMSO濃度,也與我們的研究結(jié)果有較大差異。此外緩沖液的選擇、檢測限等也沒有明確說明,影響了其實驗的重現(xiàn)性。所以在此基礎(chǔ)之上,對剛果紅與酵母β-葡聚糖的反應(yīng)體系進行進一步的優(yōu)化,明確檢測限以確定適用范圍,增設(shè)干擾物實驗確定檢測的特異性,完善剛果紅試劑-酵母β-葡聚糖的檢測方法,以期對酵母β-葡聚糖的相關(guān)研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 主要試劑
酵母β-葡聚糖、甘露聚糖,Sigma公司,酵母堿溶性β-1,3葡聚糖,Macklin公司;剛果紅,合肥博美生物科技公司;NaH2PO4、Na2HPO4、檸檬酸、檸檬酸三鈉、醋酸、醋酸鈉、二甲基亞砜(DMSO),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%剛果紅溶液(用pH 7.5的0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解)。
酵母β-葡聚糖備用液:準(zhǔn)確稱量50 mg酵母β-葡聚糖,加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的DMSO溶液,于70 ℃的水浴鍋中加熱3 h助溶,即得。
1.1.2 儀器與設(shè)備
UV-1750型紫外-可見分光光度計,島津?qū)嶒炂鞑挠邢薰?;HH-1 J型水浴鍋,常州國旺儀器制造有限公司;PHS-2F型酸度計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 反應(yīng)體系
總反應(yīng)體系為4 mL,先加入擬定量的酵母β-葡聚糖溶液,再用磷酸鹽緩沖液補足至2 mL,最后加入2 mL剛果紅試劑,以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照,測定吸光度值。
1.2.2 檢測波長與吸收差譜測定
將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度為200 μg/mL,取1 mL于試管中,加磷酸鹽緩沖液1 mL,再加2 mL剛果紅試劑;以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照,進行全波段光譜掃描。
1.2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化
1.2.3.1 最適pH對反應(yīng)的影響
考察pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對反應(yīng)體系的影響,反應(yīng)體系參照1.2.1,其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg;在25 ℃下反應(yīng)15 min,測定540 nm下的吸光度值。
1.2.3.2 最適溫度對反應(yīng)的影響
考察不同溫度對反應(yīng)的影響,設(shè)定反應(yīng)溫度為20、30、40、50、60 ℃,反應(yīng)體系參照1.2.1,其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg;在pH為7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中反應(yīng)15 min,測定540 nm下的吸光度值。
1.2.3.3 最適時間對反應(yīng)的影響
反應(yīng)體系參照1.2.1,其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg;在pH為7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中反應(yīng),反應(yīng)溫度為25 ℃,考察不同反應(yīng)時間對實驗結(jié)果的影響,選取反應(yīng)時間為5、10、15、20、25 min,分別測定540 nm下的吸光度值。
1.2.4 緩沖液種類對反應(yīng)的影響
對比pH 7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液、C6H8O7·H2O-C6H5 Na3O7·2H2O緩沖液、CH3COOH-CH3COONa·3H2O緩沖液對反應(yīng)體系的影響,反應(yīng)體系參照1.2.1,其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg,通過全波段光譜掃描確定緩沖液種類對反應(yīng)的影響。
1.2.5 DMSO對酵母β-葡聚糖溶解的影響
準(zhǔn)確稱取酵母β-葡聚糖10 mg,加入10 mL不同體積分?jǐn)?shù)(選擇為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的DMSO溶液,在70 ℃水浴鍋中處理3 h,根據(jù)酵母β-葡聚糖與剛果紅的反應(yīng)結(jié)果考察酵母β-葡聚糖在DMSO中的溶解情況。
1.2.6 剛果紅的檢測限測定
最低檢測限:將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度20 μg/mL,反應(yīng)體系參照1.2.1,在試管中分別加入0、2、4、6、8、10、12 μg的酵母β-葡聚糖,測定540 nm下的吸光度值。
最大檢測限:將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度1 mg/mL,反應(yīng)體系參照1.2.1,在試管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg的酵母β-葡聚糖,測定540 nm下的吸光度值。
1.2.7 酵母β-葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線
將酵母β-葡聚糖用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度200 μg/mL,按照表1加樣,考察不同酵母β-葡聚糖濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系。
表1 剛果紅法染色酵母β-葡聚糖實驗組 單位:mL
Table 1 Congo red staining yeast β-glucan experimental group

1.2.8 精密度實驗
將酵母β-葡聚糖備用液配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL。反應(yīng)體系參照1.2.1,分別在5組試管中加入酵母β-葡聚糖160 μg,測定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)方程,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。
1.2.9 回收率實驗
配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL的酵母β-葡聚糖備用液。反應(yīng)體系參照1.2.1。每次加入酵母β-葡聚糖的量為200 μg,測定5次。計算回收率和RSD。
1.2.10 干擾物實驗
以200 μg/mL酵母β-葡聚糖為對照品,配制200 μg/mL堿溶性β-1,3葡聚糖和甘露聚糖為干擾物,將干擾物加入反應(yīng)體系,測定吸光度3次并取平均值,以評價干擾效果和檢測方法準(zhǔn)確性。
2 結(jié)果與分析
2.1 吸收波長和吸收差譜的確定
將酵母β-葡聚糖和剛果紅反應(yīng)的復(fù)合物進行全波段光譜掃描,以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照,如圖1所示。

a-吸收波譜;b-吸收差譜
圖1 反應(yīng)復(fù)合物的全波段光譜掃描
Fig.1 Full-band spectral scanning of the reaction complex
在剛果紅體系中加入酵母β-葡聚糖后吸收光譜發(fā)生了紅移現(xiàn)象。由吸收差譜可得最大檢測吸收波長為540 nm,故此后反應(yīng)體系均采用540 nm作為測定波長。
2.2 不同因素對反應(yīng)的影響
2.2.1 pH對反應(yīng)的影響
剛果紅是一種酸堿指示劑,其pH變色范圍為3.5~5.2,與β-葡聚糖反應(yīng)時應(yīng)在剛果紅的非變色范圍內(nèi)進行測定,反應(yīng)pH與吸光度的關(guān)系如圖2-a所示:在pH 6.5~8.5內(nèi),檢測結(jié)果差異不大,F=2.455,P=0.114>0.05,pH條件為反應(yīng)的非顯著性因素。因pH 7.5時吸光度值最大,故選擇緩沖液pH為7.5。
2.2.2 溫度對反應(yīng)的影響
在不同溫度下(20~60 ℃)反應(yīng),測定吸光度,測定結(jié)果如圖2-b所示,在20~30 ℃時吸光度變化較為平緩,之后吸光度隨著溫度的升高迅速下降。溫度升高時,可能會引起1,3-β-葡聚糖鏈發(fā)生構(gòu)象變化,導(dǎo)致其結(jié)合位點容納的剛果紅分子的數(shù)量減少[13],故實驗選擇20 ℃為反應(yīng)溫度。
2.2.3 時間對反應(yīng)的影響
時間與吸光度的關(guān)系如圖2-c所示,隨著反應(yīng)時間增長,反應(yīng)的吸光度逐漸升高后趨于平緩。當(dāng)反應(yīng)時間為15 min時,吸光度達到最大值為0.231,故選擇反應(yīng)時間為15 min。β-葡聚糖與剛果紅結(jié)合后的吸收光譜是平衡時游離染料和復(fù)合物的吸收光譜之和,這是一個動態(tài)可逆反應(yīng)過程,隨著時間的變化,其反應(yīng)會逐漸趨于平衡[14]。

a-pH;b-溫度;c-時間
圖2 不同因素對反應(yīng)的影響
Fig.2 The influence of different factors on the reaction
2.3 不同種類緩沖液的選擇結(jié)果
在540 nm處,吸光度值由上至下依次為,磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、剛果紅對照液。如圖3所示。

圖3 不同緩沖液對吸光度的影響
Fig.3 The influence of different buffers on absorbance
實驗結(jié)果顯示,鹽溶液可能會導(dǎo)致β-葡聚糖無序的空間結(jié)構(gòu)向有序轉(zhuǎn)變,而有序的能更好地與剛果紅結(jié)合[14]。而在磷酸緩沖液中酵母β-葡聚糖與剛果紅結(jié)合更為靈敏,其結(jié)合度要高于其他幾種緩沖液。
2.4 不同體積分?jǐn)?shù)DMSO處理酵母β-葡聚糖的結(jié)果分析
用不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO處理酵母β-葡聚糖,其濃度與吸光度的關(guān)系如圖4所示。隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)增加,溶解的酵母β-葡聚糖逐漸增多,直接觀測法可明顯看出從50%~90%懸浮物逐漸減少,吸光度與DMSO體積分?jǐn)?shù)接近線性關(guān)系,說明此濃度范圍的DMSO溶液對酵母β-葡聚糖的空間結(jié)構(gòu)沒有破壞或破壞程度極??;在90%~100%時,溶液呈澄清透明狀,說明酵母β-葡聚糖被完全溶解,但吸光度有所降低,可能與酵母β-葡聚糖結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)。本實驗結(jié)果與其他文獻報道[15]的DMSO能破壞酵母β-葡聚糖結(jié)構(gòu)說法有所不同,可能是實驗所使用的酵母β-葡聚糖的分子質(zhì)量不同所致,其具體原因有待進一步探究。

圖4 不同含量DMSO與吸光度的關(guān)系
Fig.4 Relationship between different DMSO and absorbance
2.5 剛果紅檢測限結(jié)果分析
對酵母β-葡聚糖的最大檢測限和最小檢測限進行了實驗分析,酵母β-葡聚糖的含量與吸光度關(guān)系如圖5所示。酵母β-葡聚糖的含量為0~4 μg時,其顏色反應(yīng)不足于檢測出來;當(dāng)含量大于4 μg,吸光度隨著含量增加而接近線性關(guān)系。當(dāng)含量達到1 600 μg時,吸光度逐漸趨于平穩(wěn),其中線性較好的范圍是4~200 μg。2 mL的0.1 mg/mL剛果紅試液即為0.2 mg,可與4~1 600 μg內(nèi)酵母β-葡聚糖的發(fā)生反應(yīng)。說明酵母β-葡聚糖的三螺旋結(jié)構(gòu)片段與剛果紅分子結(jié)合有上限,并不是無限結(jié)合,其結(jié)合度與氫鍵和疏水鍵有關(guān)。

圖5 剛果紅檢測限
Fig.5 Limit of detection of Congo red
2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線
按照1.2.7步驟進行實驗,通過Origin Pro 8.5軟件擬合回歸方程,酵母β-葡聚糖在4~200 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系,回歸方程為:Y=0.001 15X-0.001 14,R2=0.998 6。
2.7 精密度實驗結(jié)果
對同一批樣品進行重復(fù)實驗,對該方法進行精密度驗證。分別在5組試管中加入相同量的酵母β-葡聚糖,測定吸光度,結(jié)果見表2,實驗結(jié)果RSD為1.154%,表明檢測方法重復(fù)性良好,可作為酵母β-葡聚糖檢測方法使用。
表2 精密度實驗結(jié)果
Table 2 Precision test results

2.8 回收率實驗結(jié)果
在酵母β-葡聚糖樣品中加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品,測定回收率,實驗結(jié)果如表3所示,其平均回收率為100.32%,RSD為1.11%。準(zhǔn)確度高,可滿足一般檢測的需要。
表3 回收實驗結(jié)果
Table 3 Experimental results of sampling recovery

2.9 干擾物實驗結(jié)果
以酵母β-葡聚糖為對照組,在干擾組中分別加入β-1,3葡聚糖和甘露聚糖,測定干擾率,實驗結(jié)果如表4所示。
表4 干擾物實驗結(jié)果
Table 4 Experimental results of interference

結(jié)果顯示,β-1,3葡聚糖干擾率(0.587%)<精密度(RSD=1.154%),說明β-1,3葡聚糖對檢測的結(jié)果影響較?。欢事毒厶菍Ψ磻?yīng)有較大的影響,但是在實際樣品的檢測中,經(jīng)過預(yù)處理后的甘露聚糖已經(jīng)被去除,并不影響測定結(jié)果。
3 討論與結(jié)論
實驗利用剛果紅與酵母β-葡聚糖特異性結(jié)合的性質(zhì),對酵母β-葡聚糖進行定量檢測,避免了傳統(tǒng)檢測方法間接、多步測定和誤差偏大的缺點,顯示出一定的優(yōu)越性。對剛果紅和酵母β-葡聚糖的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化,結(jié)果顯示,0.1 mol/L,pH 7.5磷酸緩沖液使反應(yīng)靈敏度提高,最低檢出限提高為4 μg;溫度影響剛果紅和酵母β-葡聚糖兩者的結(jié)合度,在20 ℃下,結(jié)合度最大。15 min時,反應(yīng)可以達到平衡。在此優(yōu)化條件下進行驗證實驗。精密度RSD為1.160%,平均回收率為100.32%,相比優(yōu)化前具有更好的精密度和更高的回收率,測定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定;干擾性實驗顯示,反應(yīng)不受堿溶性β-1,3葡聚糖的干擾,而受甘露聚糖影響較大。酵母β-葡聚糖為不溶性物質(zhì),經(jīng)過預(yù)處理以及中間的制備過程,可溶性的甘露聚糖幾乎被完全去除,幾乎無法檢出。因此,按照制備過程得到的酵母β-葡聚糖樣品可以忽略甘露聚糖對反應(yīng)的影響。但是對于市售的酵母細胞壁產(chǎn)品而言,其中存在較多的甘露聚糖,檢測前的預(yù)處理極為必要,須去除甘露聚糖才可以確保檢測的準(zhǔn)確性。
DMSO溶解實驗說明,有效溶解酵母β-葡聚糖需要較高濃度的DMSO,酵母β-葡聚糖溶解度與DMSO作助溶劑時濃度間存在近似的線性關(guān)系,由此推測高濃度的DMSO并沒有對酵母β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)造成破壞或者破壞極小,這與其他文獻報道[15]的結(jié)果存在一定的差異,所以還需進行更深一步探討。
本實驗完善了剛果紅與酵母β-葡聚糖反應(yīng)的具體條件,使之更具可操作性,對酵母細胞壁產(chǎn)品中的β-葡聚糖的檢測具有參考價值。
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