磁性Fe3O4納米粒子固定化酶及其在食品中的應(yīng)用

酶是一種具有高效性、專一性、催化條件溫和無污染等特點(diǎn)的生物催化劑，在食品加工、生物醫(yī)藥、水處理、能源等研究領(lǐng)域中有著巨大的應(yīng)用潛力[1]。然而，大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，易受溫度、pH以及重金屬鹽等環(huán)境因素影響而變性或失活，使其難以回收利用和連續(xù)化生產(chǎn)。固定化酶具有較高的催化特性和穩(wěn)定性，可以有效提高酶的利用率。隨著20世紀(jì)60年代固定化材料和酶工程領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展[2]，固定化酶技術(shù)開拓了更加廣闊的應(yīng)用前景。

目前，新型固定化酶技術(shù)的研究主要集中在2個(gè)方面：一是固定化新技術(shù)的開發(fā)及傳統(tǒng)固定化技術(shù)的改進(jìn)，如交聯(lián)酶聚集體、物理輔助固定化技術(shù)、膜固定化技術(shù)等的開發(fā)與應(yīng)用[3]；二是新型固定化材料的開發(fā)研究，如金屬有機(jī)框架材料(metal-organic frameworks,MOFs)、共價(jià)有機(jī)框架材料(covalent-organic frameworks,COFs)以及磁性納米材料等[4]。其中，磁性Fe3O4納米粒子作為酶固定化的新型載體，具有良好的生物相容性、粒徑小、比表面積大、超順磁性、較高的載酶量及在溶液中穩(wěn)定存在等優(yōu)點(diǎn)[5]。同時(shí)該粒子不僅可以通過施加外界磁場(chǎng)快速地從反應(yīng)體系中分離出來，促進(jìn)酶的有效回收和循環(huán)利用，還可以與多種材料復(fù)合，利用這些復(fù)合材料獨(dú)特的物理或表面特性(提供醛基、羥基、羧基和氨基等基團(tuán))提高酶的固定效率，解決單一材料在固定化酶領(lǐng)域所存在的缺陷問題[6]。另外，穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)能夠在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境中保護(hù)酶的活性，使其在固定化酶、生物醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用中發(fā)揮巨大的作用。本文綜述了磁性Fe3O4納米粒子的制備、酶固定化方法及其固定不同種類酶的最新研究，最后總結(jié)其在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為促進(jìn)磁性Fe3O4納米粒子固定化酶技術(shù)的應(yīng)用研究提供參考。

1 磁性Fe3O4納米粒子

1.1 磁性Fe3O4納米粒子的特性

磁性納米顆粒是由聚合物和磁性材料組成的新型有機(jī)-無機(jī)功能材料。其中，F(xiàn)e3O4納米粒子是目前最受歡迎的磁性固定化材料，具有高飽和磁化強(qiáng)度、超順磁性和大比表面積等優(yōu)點(diǎn)，目前在藥物遞送和酶固定化領(lǐng)域備受關(guān)注[5]。但Fe3O4非常不穩(wěn)定，在空氣中很容易被氧化成其他物質(zhì)，降低了材料的磁性和分散性。此外，F(xiàn)e3O4暴露的表面具有化學(xué)活性，可能會(huì)導(dǎo)致酶蛋白的失活[7]。為了克服這些問題，采用無機(jī)或有機(jī)材料與裸露的Fe3O4形成納米復(fù)合材料。磁性核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料是最有前途的多功能材料之一，在酶固定化方面受到越來越多的關(guān)注，如圖1所示。

1.2 磁性Fe3O4納米粒子的制備

Fe3O4納米粒子的應(yīng)用十分廣泛，其制備方法多種多樣，主要有機(jī)械球磨法、水熱法、高溫分解法、微乳液法、共沉淀法等[8-9]，其制備原理和優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

圖1 Fe3O4核殼結(jié)構(gòu)固定化酶形成過程示意圖
Fig.1 Schematic diagram of the formation of Fe3O4 core-shell structure immobilized enzyme

表1 Fe3O4納米粒子的制備方法
Table 1 Preparation method of Fe3O4 nanoparticles

1.3 磁性Fe3O4納米粒子固定化酶的方法

通過物理或化學(xué)方法將游離酶與特定的載體材料結(jié)合實(shí)現(xiàn)酶的固定化。酶固定化的方法主要包括吸附法、包埋法、交聯(lián)法與共價(jià)法等以及多種方法結(jié)合的技術(shù)[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，采用化學(xué)試劑對(duì)Fe3O4納米粒子及其核殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使酶分子上的氨基酸殘基與載體上特定官能團(tuán)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合，可以快速有效地實(shí)現(xiàn)酶的固定化。AKHOND等[13]研究了氨基功能化的納米粒子修飾的磁性納米粒子共價(jià)固定豬胰腺α-淀粉酶的潛力。研究表明固定后α-淀粉酶保留了50%以上的初始比活性。與游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定較好，在重復(fù)使用9次后依然保持68%的初始活性。CHENG等[14]提出了一種將α-葡萄糖苷酶直接共價(jià)固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的Fe3O4納米粒子上的方法。與游離酶相比，固定化α-葡萄糖苷酶的耐酸堿度和熱穩(wěn)定性略有提高。此外，固定化α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出良好的重復(fù)利用性，經(jīng)7次循環(huán)后，剩余活性仍達(dá)到66.0%。

2 磁性Fe3O4納米粒子固定化酶

2.1 磁性Fe3O4納米粒子固定化脂肪酶

脂肪酶(三?；视王ニ饷?是一種良好的熱穩(wěn)定生物催化劑，可用于不同的工業(yè)領(lǐng)域，如洗滌劑、油脂化學(xué)品、食品添加劑、生物柴油、紡織等[15-16]。然而，游離脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用通常因其容易失活、操作穩(wěn)定性低和循環(huán)利用困難而受到阻礙，將其固定在合適的載體上可以有效地克服這些缺點(diǎn)，以改善酶的特性。

目前，脂肪酶固定化的各種載體及其性質(zhì)已被廣泛研究。如，WANG等[17]研發(fā)了一種無表面活性劑、經(jīng)濟(jì)和綠色的高分散Fe3O4@MIL-100(Fe)磁性核/殼復(fù)合微球，其具有合適的孔徑(7.07 nm)、高比表面積(137.27 m2/g)和高磁化強(qiáng)度(49.67 emu/g)。將假絲酵母脂肪酶作為模型酶固定在核殼微球上。發(fā)現(xiàn)固定化酶在65 ℃下水解橄欖油6 h后仍保持65%左右的初始活性；并且在第10次催化運(yùn)行后，殘余活性仍保持初始活性的60%。這可能歸功于Fe3O4@MIL-100(Fe)大的表面積和孔徑以及MOFs中游離羧基和不飽和金屬中心的存在，使其具有較高的負(fù)載量。這與MOSAYEBI將七型假絲酵母脂肪酶固定在(3-辛基)三甲氧基硅烷功能化氧化石墨烯納米復(fù)合材料(GO-Fe3O4)的研究結(jié)果一致[18]。因此，F(xiàn)e3O4核殼型磁性微球在環(huán)境保護(hù)、化學(xué)生物傳感器、納米電子學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 磁性Fe3O4納米粒子固定化蛋白酶

目前研究較多的蛋白酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等。酶解產(chǎn)物不僅可以增大蛋白的溶解性、乳化性等物理特性，還可以得到易于消化吸收，具有多種活性的功能性肽段，已被廣泛應(yīng)用在生物、制藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域[19]。

在蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的生產(chǎn)中，游離形式的酶通常需加熱滅活，但加熱可能會(huì)使蛋白變性或促進(jìn)聚集體的形成，而磁性Fe3O4納米粒子固定化酶可以通過磁性分離回收酶，消除了酶失活過程可能引起的潛在變化，并獲得無殘留酶的水解產(chǎn)物。如CAO等[20]制備一種由磁性Fe3O4納米粒子和一層金納米粒子組成的固定化載體。金納米粒子作為中間配體，將胰蛋白酶可逆地固定從而得到一種生物反應(yīng)器，并將其用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的消化。結(jié)果表明，與使用游離胰蛋白酶及常規(guī)固定化技術(shù)(如靜電相互作用、共價(jià)鍵合和形成金屬螯合物)相比，其酶催化效率更高。CHEN等[21]研究以殼聚糖和三聚磷酸鈉包覆的磁性納米粒子(Fe3O4@CSTPP)為載體，開發(fā)了一種新型高效的雙酶(堿性蛋白酶與胰蛋白酶)同步固定化方法，研究發(fā)現(xiàn)DE-Fe3O4@CS-TPP納米粒子具有較高的熱穩(wěn)定性，在貯藏35 d后，其活性保持86%，連續(xù)重復(fù)使用10次后，仍保持60%以上的初始活性。DE-Fe3O4@CS-TPP納米粒子在米糠、核桃、紅小豆、玉米醇溶蛋白和酪蛋白等各種蛋白質(zhì)水解過程中顯示出良好的水解度、產(chǎn)率，同時(shí)由其水解制備的蛋白肽具有更高抗氧化活性。

2.3 磁性Fe3O4納米粒子固定化漆酶

漆酶是一種分子質(zhì)量為50～90 kDa的含銅多酚氧化酶，廣泛分布于真菌、植物、細(xì)菌和昆蟲中。它可以通過促進(jìn)苯酚和二元胺的甲氧基取代來氧化多酚或其他具有類似多酚結(jié)構(gòu)的底物[22]。然而，漆酶重復(fù)使用性差、穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)阻礙了漆酶的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，漆酶的固定化引起了廣泛的關(guān)注和研究。

酶固定化技術(shù)可以提高酶的整體穩(wěn)定性和回收能力，促進(jìn)酶在更多領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。與大多數(shù)復(fù)雜繁瑣的酶固定化過程相比，ZHANG等[23]采用自組裝方法制備了載體Fe3O4@殼聚糖(Fe3O4@CS)復(fù)合納米粒子，并將漆酶共價(jià)固定Fe3O4@CS復(fù)合納米粒子，研究去除水中的氯酚效率。結(jié)果表明，固定化漆酶的比活性達(dá)到112.4 U，活性回收率為51.8%。與游離漆酶相比，固定化漆酶具有更高的耐酸堿度、熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，這可能是由于漆酶與載體之間的結(jié)合增加了結(jié)構(gòu)剛性并減少了構(gòu)象變化。隨著復(fù)合納米粒子制備技術(shù)不斷創(chuàng)新，CHEN等[24]首次提出同軸電噴霧制備核/殼復(fù)合納米粒子固定化漆酶降解銀杏酸的方法，固定化后漆酶在60～90 ℃熱穩(wěn)定性較高，用其降解銀杏酸，速率常數(shù)(k)和時(shí)間(τ50)分別低于0.02 min-1和39 min，表現(xiàn)出良好的催化性能。此外在儲(chǔ)存21 d或重復(fù)使用5次后顯示出高于0.5的相對(duì)活性，具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性。隨著固定化酶技術(shù)的不斷發(fā)展，可實(shí)現(xiàn)漆酶的固定化，更有希望實(shí)現(xiàn)漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4 磁性Fe3O4納米粒子固定化其他酶

近年來，磁性納米材料已經(jīng)成為重要的納米材料，被用來固定各種功能的酶，如淀粉酶、蝸牛酶、脫氫酶、葡萄糖苷酶、果膠酯酶、過氧化氫酶、內(nèi)酰胺酶、碳酸酐酶等。

YILMAZ等[25]研究了α-淀粉酶固定在修飾的磁性碳納米管磁性納米粒子(α-淀粉酶-Fe3O4/多壁碳納米管)作為萃取劑對(duì)食品中金屬離子進(jìn)行微萃取的可行性。在微萃取中發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶-Fe3O4/多壁碳納米管重復(fù)使用6次仍保持較高的萃取效率，砷的提取率高于95%，該方法已成功應(yīng)用于不同大米和面粉樣品中砷含量的分析。LI等[26]合成了球形的50 nm羧化殼聚糖包裹的磁鐵礦納米粒子(Fe3O4@CYCTS)，并首次將其應(yīng)用于蝸牛酶的固定化。結(jié)果顯示，在60 ℃孵育60 min后，固定化蝸牛酶的剩余活性為40.7%，約是游離酶的4倍。同時(shí)固定化酶在化學(xué)變性劑(2%十二烷基硫酸鈉、60%乙醇和6 mol/L尿素)的作用下仍保留了大部分初始活性。WANG等[27]將磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)固定在Fe3O4納米粒子上以提高其降解組胺的性能。發(fā)現(xiàn)固定化GAPDH在70 ℃時(shí)仍保持約31.4%的活性，同時(shí)固定化酶顯示出良好的可重復(fù)使用性(在5次使用循環(huán)后保留了近60%的活性)。固定化GAPDH降解了葡萄和黑樹莓酒80%以上的組胺，對(duì)酒成分的影響微乎其微，表明Fe3O4-GAPDH的酶促技術(shù)在降低發(fā)酵飲料中生物胺方面具有巨大潛力。

3 固定化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

3.1 在油脂改性中的應(yīng)用

脂肪酶是一種能夠顯著提高油脂催化效率的綠色生物催化劑，在油脂工業(yè)中應(yīng)用廣泛，可通過水解、氨解、酯化、酯交換等反應(yīng)達(dá)到油脂改性的目的[28]。如GAO等[29]成功合成了單分散核殼型磁性有機(jī)硅納米花，并將其用作南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)共價(jià)固定化的載體。CALB@納米花可以有效地催化不同鏈長(zhǎng)乙酰丙酸醇(正丁醇、正辛酸、正月桂醇)酯化反應(yīng)合成乙酰丙酸烷基酯?；厥?0次后，CALB@納米花保留了85%以上的催化合成乙酰丙酸丁酯的初始活性和96%以上的催化合成長(zhǎng)鏈烷基乙酰丙酸酯的初始活性，具有可調(diào)皺紋通道的疏水納米花的設(shè)計(jì)為酶的固定化開辟了一條新的途徑以提高酶的催化活性和穩(wěn)定性。MIAO等[30]利用戊二醛活化法將脂肪酶成功固定在磁性Fe3O4納米粒子上，制備的固定化脂肪酶作為生物催化劑用于菜籽油與甲醇酯交換制備生物柴油。結(jié)果表明，在甲醇與油的摩爾比為6∶1的條件下，使用固定化脂肪酶作為催化劑，在45 ℃下反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯的最大轉(zhuǎn)化率為89.4%，催化劑重復(fù)使用5次后，脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化率保持在70%。

3.2 在果汁澄清中的應(yīng)用

鮮果汁中果膠、淀粉、纖維素和半纖維素等多糖成分在儲(chǔ)存過程中容易沉淀，形成混濁的果汁懸浮液，這是造成品質(zhì)不佳的主要原因之一[31]。酶處理果汁可提高最終產(chǎn)品的產(chǎn)量、安全性、保質(zhì)期和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，同時(shí)保持果汁固有的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。DAL等[32]制備3種不同尺寸的磁性殼聚糖顆粒并用于果膠酶的固定和果汁的澄清。研究發(fā)現(xiàn)，在橙汁澄清過程中固定化果膠酶經(jīng)過25次間歇循環(huán)后，仍保持85%的初始活性。LADOLE等[33]通過交聯(lián)將果膠酶和柚皮苷酶同時(shí)固定在環(huán)保型殼聚糖包覆磁性納米粒子上，并評(píng)價(jià)了共固定化生物催化劑對(duì)葡萄柚汁的澄清和脫苦效果。結(jié)果表明，葡萄柚汁濁度降低約52%，柚皮苷含量降低約85%。共固定化酶可循環(huán)使用7次，殘留活性為64%，在室溫下保存30 d，殘留活性為86%。目前已有將固定化酶技術(shù)應(yīng)用于澄清蘋果汁、菠蘿汁、葡萄汁和胡蘿卜汁等的報(bào)道[34-35]。

3.3 在乳制品生產(chǎn)中的應(yīng)用

牛乳含有3.3%～3.5%的蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，是母乳最好的替代品。但牛乳中的蛋白質(zhì)可能會(huì)引起過敏反應(yīng)，影響嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至威脅其生命。目前降低牛乳蛋白致敏性的主要方法是酶水解法，該法主要是通過蛋白質(zhì)肽鍵的斷裂，將過敏蛋白水解成小分子肽段，破壞其過敏位點(diǎn)[36]，從而達(dá)到降低其致敏性的目的。FENG等[37]制備了Fe3O4納米粒子與Cu2(PO4)2·3H2O新型納米花催化材料，成功結(jié)合木瓜蛋白酶后水解牛乳致敏蛋白，SDS-PAGE顯示，隨著時(shí)間的增加，牛奶中的大部分致敏蛋白(β-乳球蛋白、α-乳白蛋白)在30 min時(shí)水解完全，酪蛋白也被大量水解，為低致敏性易消化牛奶的生產(chǎn)提供了一種新方法。

3.4 在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)食品安全越來越重視。因此，準(zhǔn)確有效地分析食品以獲得有效的檢測(cè)結(jié)果是一個(gè)亟待解決的問題。在眾多檢測(cè)技術(shù)中，磁性納米粒子作為一種新的檢測(cè)方法已被證明是檢測(cè)食品安全的合適方法[38]。ZHANG等[39]提出了一種磁性石墨烯(G-Fe3O4)測(cè)定5種苯并咪唑類化合物(奧芬達(dá)唑、甲苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑和芬苯達(dá)唑)的新方法，并建立了基于G-Fe3O4磁性固相萃取和高效液相色譜聯(lián)用的方法。測(cè)定了雞肉、雞血和雞肝樣品中的痕量苯并咪唑，這些樣品中的奧芬達(dá)唑、甲苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑和芬苯達(dá)唑的濃度分別為13.0～20.2、1.62～4.64、1.94～6.42和0.292～1.04 ng/g?；厥章蕿?3.0%～115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.9%。該方法靈敏、可靠，適用于食品中痕量苯并咪唑的分析。類似的，WANG等[40]開發(fā)了基于磁性沸石咪唑骨架-8(Fe3O4@ZIF-8)的簡(jiǎn)易磁性固相萃取技術(shù)，F(xiàn)e3O4@ZIF-8與高效液相色譜聯(lián)用為同時(shí)測(cè)定塑料包裝飲料和食品中的聚合物添加劑提供了一種有效的富集和測(cè)定方法。TONG等[41]構(gòu)建了對(duì)5種鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)具有優(yōu)異親和力、良好可重復(fù)使用性和快速分離的核殼Fe3O4@石墨碳亞微米立方體，并與高效液相色譜聯(lián)用，同時(shí)檢測(cè)飲料和塑料瓶中的5種痕量PAEs。這不僅建立了一種同時(shí)測(cè)定5種PAEs的有效方法，還為以低成本、可回收餐巾紙為碳源設(shè)計(jì)或構(gòu)建磁性石墨碳包覆核殼材料開辟了新的策略。

3.5 在生物活性肽制備中的應(yīng)用

生物活性肽因具有降膽固醇、降血壓、抗菌、抗氧化等生物活性而成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[42]。馬瑞娟等[43]采用磁性交聯(lián)酶聚集體技術(shù)制備的固定化酶酶解鳀魚蒸煮液制備蛋白多肽，并分析所制備水解肽的性能。分析酶解液的必需氨基酸指數(shù)>0.95，分子質(zhì)量低于1 500 Da的小肽占82.52%，且具有較強(qiáng)的抗氧化性。KUAN等[44]將泛素樣特異性蛋白酶1(sfULP1)固定在結(jié)合谷胱甘肽的磁性納米顆粒上，然后切割泛素樣修飾物并獲得了胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)。GLP-1是一種低分子質(zhì)量肽和腸促胰島素激素，具有抗高血糖潛力，對(duì)2型糖尿病治療有意義的肽激素。

4 展望

固定化酶以其高催化效率、高穩(wěn)定性、可重復(fù)利用性已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的多個(gè)領(lǐng)域，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展來看，仍然有很多挑戰(zhàn)。一方面，大多數(shù)固定化酶種類主要是脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等，而研究轉(zhuǎn)移酶類、裂合酶類和異構(gòu)酶類等相對(duì)較少。另一方面，固定化酶的復(fù)合材料制備成本相對(duì)較高，比如MOFs和COFs材料等。因此，未來可著重探索新的固定化技術(shù)和載體，制備多種酶共同固定；探究固定機(jī)理，獲得具有高催化效應(yīng)的新型固定化酶，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。隨著生物技術(shù)、化學(xué)、材料等其他相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，固定化酶將在食品、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域有更廣闊的應(yīng)用前景。