發(fā)酵牛肉香腸肽的抗氧化穩(wěn)定性研究

近年來，隨著人們食品安全意識的提高，抗氧化肽因安全性高、易吸收、活性強等優(yōu)點引起了研究者的廣泛關(guān)注[1-2]。目前，已有部分抗氧化肽作為功能性食品和藥品實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[3-4]。抗氧化肽由蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生，在加工和貯藏過程中會發(fā)生水解、氧化、脫酰胺、環(huán)化等反應(yīng)，導(dǎo)致肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其生物活性[5]?？寡趸牡姆€(wěn)定性與溶液的酸堿性、溫度和鹽離子濃度等密切相關(guān)[6-7]，因此，對其在不同環(huán)境下穩(wěn)定性的研究極其重要。

發(fā)酵肉制品是指在自然或人工控制的環(huán)境中，利用微生物或酶的作用使原料肉發(fā)生一系列復(fù)雜變化，形成具有良好的貯藏性和獨特風(fēng)味、色澤與質(zhì)地的肉制品，其在生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)會發(fā)生強烈水解而產(chǎn)生具有生物活性的肽類物質(zhì)[8]。郭世良等[9]酶解得到發(fā)酵酸肉肽，并發(fā)現(xiàn)強酸強堿、高溫、高糖、高NaCl及銅、鋅離子不利于其抗氧化活性的保持。ZHU等[10]用鹽酸浸提得到金華火腿抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)其在酸性和中性條件下抗氧化活性較好，模擬胃腸消化會降低其活性。欒曉旭等[5]用磷酸浸提法從豬肉發(fā)酵香腸中提取到多肽，并發(fā)現(xiàn)在高溫和酸堿性環(huán)境中多肽活性喪失較快，糖類和NaCl會提高其自由基清除活性。可見，發(fā)酵肉制品中多肽抗氧化穩(wěn)定性的研究主要集中在發(fā)酵酸肉、腌制火腿和豬肉香腸上，而以牛肉為原料制作的發(fā)酵香腸研究較少；同時，香腸制作方式不同，多肽提取方法不同，其抗氧化穩(wěn)定性也可能產(chǎn)生差異。因此，以牛肉為試材制備發(fā)酵香腸，并探究其多肽在不同環(huán)境的穩(wěn)定性顯得尤為重要。

本試驗采用鹽酸浸提法從發(fā)酵牛肉香腸中得到具有強抗氧化活性的多肽，研究熱處理、pH值、金屬離子、常溫貯存時間及模擬胃腸消化對其抗氧化活性的影響，為發(fā)酵牛肉香腸肽作為功能性食品和抗氧化劑的開發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛后腿肉，采自甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團有限公司；豬背膘、腸衣、食鹽等，購于江蘇雨潤肉食品有限公司；發(fā)酵劑(包括乳酸片球菌與戊糖片球菌)，科漢森食品添加劑有限公司；DPPH、亞硝酸鈉、抗壞血酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶，日本Solarbio公司；濃硫酸、濃鹽酸、三氯乙酸、水楊酸等(分析純)，乙腈、甲醇、正己烷等(色譜純)，蘭州新區(qū)鑫鑫尚信試劑經(jīng)銷部。

1.2 儀器與設(shè)備

H2050R全自動高速冷凍離心機，北京海天友誠科技有限公司；RE-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SPectramax M2型酶標(biāo)儀，美國美谷分子儀器有限公司；FR-500型組織勻漿機，寧波新芝科器研究所；UV-8000T型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Rigol L3000高效液相色譜儀，德國SYKAM公司；ES2030冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵牛肉香腸的制備

工藝流程如下：

原料肉預(yù)處理→瘦肉絞碎、肥肉切丁→添加輔料、攪拌腌制→灌腸→發(fā)酵→干燥成熟→真空包裝→成品

操作要點：牛后腿肉要求新鮮，無筋膜、淤血及其他雜質(zhì)，與豬背部脂肪一起漂洗干凈，將瘦肉攪碎，肥肉切丁，按m(肥)∶m(瘦)=2∶8混合，以混合后的肉質(zhì)量為基礎(chǔ)，其他配料按鹽2.5%、抗壞血酸0.05%、亞硝酸鈉0.005%、蔗糖1%、葡萄糖1%、水10%和發(fā)酵劑0.025%添加(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))不斷攪拌直至調(diào)料均勻，顏色均一，肉餡之間有黏連性，然后在4 ℃腌制12 h。將腌制后的肉餡灌入腸衣，灌裝過程中應(yīng)注意排氣，防止腸體爆裂，灌裝后的腸體應(yīng)飽滿緊繃，無肉眼可見氣泡。腸體清洗干凈后在24 ℃和92%相對濕度下發(fā)酵3 d，然后在14 ℃ 和77%相對濕度條件發(fā)酵并干燥32 d。取樣時，應(yīng)去除腸衣，避免裸露產(chǎn)品表皮黏上白霉。

1.3.2 多肽的提取[10]

準(zhǔn)確稱取20 g樣品，加入120 mL 0.06 mol/L HCl，勻漿(10 000 r/min，20 s×3)，靜置(4 ℃，2 h)，離心(10 000 r/min，4 ℃，20 min)。上清液經(jīng)紗布過濾后加入4倍體積30%乙醇，靜置過夜(12 h)，相同條件下再次離心，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥得到多肽粉末。

1.3.3 體外抗氧化能力的測定

按照ZHU等[10]的方法測定DPPH自由基清除能力；參考馮美琴等[11]的方法測定羥自由基清除能力和鐵還原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)；參照YANG等[12]的方法測定清除超氧陰離子自由基的能力。

1.3.4 乳化活性與乳化穩(wěn)定性的測定

參照GUO等[13]的方法測定乳化活性(emulsifying activity index，EAI)與乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index，ESI)。以9∶1的體積比將多肽溶液與大豆油混合，乳化1 min后立即在距燒杯底5 mm處吸取30 μL乳化液，均勻分散在3 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液中，測定500 nm處吸光度值，同時以0.1% SDS溶液作為空白。計算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：A0、A10,靜置0、10 min的吸光度；D,稀釋倍數(shù)；c,肽溶液的質(zhì)量濃度，g/mL；φ,油相體積分?jǐn)?shù)；10 000,校正系數(shù)。

1.3.5 起泡特性與泡沫穩(wěn)定性

參考張京濤等[14]的方法，多肽起泡特性的計算如公式(3)和公式(4)所示：

起泡能力

(3)

泡沫穩(wěn)定性

(4)

式中：V0、V30分別表示勻漿液靜置0、30 min的泡沫體積。

1.3.6 游離氨基酸組成的測定

將100 μL樣品、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(17種，2.5 μmol/mL)、三乙胺乙腈溶液(pH>7.0)混合，加入10 μL 正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液和50 μL異硫氰酸苯酯乙腈溶液，靜置1 h(25 ℃)，再加入200 μL正己烷，靜置10 min，下層溶液用0.45 μm濾膜過濾后上樣分析。高效液相色譜采用Kromasil C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為40 ℃；流速為1 mL/min；無水乙酸鈉-乙腈水溶液(pH 6.5)作為流動相A；80%乙腈水溶液作為流動相B。

1.3.7 發(fā)酵牛肉香腸肽體外抗氧化能力的穩(wěn)定性研究

1.3.7.1 熱處理對多肽抗氧化活性的影響

將多肽在室溫、40、60、80、100 ℃溫度下分別處理20 min 以及在100 ℃條件下分別處理0、10、20、30、40 min，冷卻至室溫測定DPPH自由基清除率、FRAP。

1.3.7.2 pH對多肽抗氧化活性的影響

用HCl和NaOH(1 mol/L)調(diào)整多肽溶液pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫振蕩反應(yīng)2 h，測定DPPH自由基清除率、FRAP。

1.3.7.3 金屬離子對多肽抗氧化活性的影響

配制質(zhì)量濃度為2 g/L的肽液，分別添加0、50、100、150、200、250 mg/L的NaCl和KCl，室溫振蕩反應(yīng)2 h，測定樣品的抗氧化能力。

1.3.7.4 貯存時間對多肽抗氧化活性的影響

將多肽提取液在常溫下分別存放0、1、2、3、4 d，然后按照上述方法測其活性，研究貯存時間對其抗氧化活性的影響。

1.3.7.5 模擬胃腸消化對多肽抗氧化活性的影響

參照ZHU等[10]的方法并稍作修改。將多肽液pH值用HCl(1 mol/L)調(diào)至2.0，添加胃蛋白酶(3 000 U/mg)，保持溫度37 ℃，持續(xù)酶解2 h，酶解液置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫后離心(4 ℃、6 000 r/min，10 min)。將上清液分為2份，1份用于測定多肽液經(jīng)模擬胃消化后抗氧化活性的變化，另1份用NaOH(1 mol/L)調(diào)pH至7.0，添加胰蛋白酶(250 U/mg)，保持溫度37 ℃，持續(xù)酶解2 h后滅酶，冷卻，離心，收集上清液，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每個處理做3次重復(fù)試驗，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，采用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響

熱處理是食品加工中常用的手段，在較高溫度下多肽能否保持高活性，是評價其是否具有商業(yè)潛力的重要因素[6]。由圖1-a可知，常溫時DPPH自由基清除活性為69.8%，100 ℃時清除活性為72.2%，升高了2.4%。這可能是因為高溫處理雖然改變了多肽的空間構(gòu)象，但其肽鏈并沒有斷裂，只是部分二級結(jié)構(gòu)展開，暴露出一些活性位點，使DPPH自由基清除活性增強[15]。FRAP值在40 ℃時顯著下降(P<0.05)，之后溫度對其無顯著影響(P>0.05)。圖1-b是同一溫度不同處理時間對樣品抗氧化能力的影響。DPPH自由基清除活性和FRAP值在加熱10 min時顯著下降(P<0.05)，20 min后加熱時間對DPPH自由基清除活性無顯著影響(P>0.05)，F(xiàn)RAP在30 min時最高。肖嵐等[16]發(fā)現(xiàn)牦牛血低聚肽的羥自由基清除活性在100 ℃處理5 h仍有84.32%，與本實驗結(jié)果一致。因此，發(fā)酵牛肉香腸肽具有較好的熱穩(wěn)定性，在其提取和加工處理中，熱處理并不會影響其活性。

2.2 pH對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響

pH可通過影響肽的電離勢和電子轉(zhuǎn)移能力來影響肽的抗氧化活性[5]。由圖2可知，在pH為3.0時，發(fā)酵香腸肽的DPPH自由基清除活性和FRAP值最高，分別為91.64%和0.306，之后隨著pH上升顯著下降(P<0.05)。在中性環(huán)境(pH 7.0)時，DPPH自由基清除活性仍能保持70%以上，當(dāng)其處于堿性環(huán)境(pH 11.0)，清除活性較pH 3.0下降了46.56%。因此，發(fā)酵香腸中多肽的DPPH自由基清除活性對堿性環(huán)境更敏感，肽類物質(zhì)在堿性環(huán)境下會發(fā)生脫酰胺或外消旋反應(yīng)，從而導(dǎo)致多肽活性下降[5]。綜上所述，發(fā)酵牛肉香腸肽的耐堿性較弱，為了保持較好的抗氧化活性，應(yīng)避免其處于強堿性環(huán)境中。

a-熱處理溫度對發(fā)酵香腸肽DPPH自由基清除率的影響； b-熱處理時間對發(fā)酵香腸肽DPPH自由基清除率的影響
圖1 熱處理對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響
Fig.1 Changes in antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages in different temperature 注：圖中小寫字母不同表示不同處理間DPPH自由基清除能力差異顯著 (P<0.05)，大寫字母不同表示還原力差異顯著(P<0.05)(下同)

圖2 pH對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響
Fig.2 Changes in antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages in different pH

2.3 金屬離子對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響

食品體系中金屬離子廣泛存在，攝入適量金屬離子對機體的生理平衡有重要意義[6]。由圖3-a可以看出，隨著Na+濃度的提高，多肽的DPPH自由基清除活性顯著上升，當(dāng)Na+質(zhì)量濃度為150 mg/L時，DPPH自由基清除活性達(dá)到最大值84.77%；相反地，F(xiàn)RAP值隨Na+濃度升高顯著降低(P<0.05)；當(dāng)Na+質(zhì)量濃度為200 mg/L時，DPPH自由基清除活性和FRAP值均能達(dá)到較高水平。可能是因為NaCl溶液電離產(chǎn)生的Cl-和Na+能中和香腸多肽表面的電荷，使水化膜遭到破環(huán)，暴露出的供氫或供質(zhì)子體與自由基結(jié)合，抗氧化活性隨之增強[9]。

圖3-b反映的是K+濃度對多肽抗氧化能力的影響。當(dāng)K+的質(zhì)量濃度為50 mg/L時，DPPH自由基清除活性達(dá)到最大值86.87%，但此時FRAP下降至最低值；當(dāng)K+的質(zhì)量濃度為150 mg/L時，DPPH自由基清除活性和FRAP值均維持在較高水平。PEREIRA等[17]研究指出肽與含有NaCl的食品基質(zhì)之間的相互作用有利于肽生物活性的維持；孫浩等[7]研究發(fā)現(xiàn)K+會提高苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率，這與本實驗的結(jié)果相一致。綜上，適量的Na+、K+會增強發(fā)酵牛肉香腸肽的抗氧化活性，Na+質(zhì)量濃度為200 mg/L，K+質(zhì)量濃度為150 mg/L時抗氧化活性最好。

a-Na+濃度對抗氧化活性的影響；b-K+濃度對抗氧化活性的影響
圖3 Na+、K+濃度對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響
Fig.3 Changes in antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages in different Na+ and K+ contents

2.4 貯存時間對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響

發(fā)酵香腸肽在提取分離過程中易長時間暴露在空氣中，對活性產(chǎn)生影響。圖4為其室溫下處理0、1、2、3、4 d的結(jié)果。當(dāng)處理1 d時，與對照相比DPPH自由基清除活性上升了約10%，當(dāng)處理2 d時，活性下降顯著(P<0.05)，之后隨處理時間延長無顯著變化(P>0.05)，F(xiàn)RAP整體變化差異不顯著(P>0.05)。可能是因為肽段暴露在空氣中發(fā)生了氧化反應(yīng)或吸濕后發(fā)生了水解反應(yīng)，導(dǎo)致多肽結(jié)構(gòu)和氨基酸組成發(fā)生改變，使活性降低[18]。因此，對發(fā)酵牛肉香腸肽進(jìn)行提取和分離時，應(yīng)注意控制溫度和時間，避免其長時間暴露在空氣中。

圖4 貯存時間對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響
Fig.4 Changes in antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages in different storage time

2.5 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽活性的影響

2.5.1 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，EAI與ESI的變化相似，經(jīng)過2 h模擬胃消化后，EAI和ESI顯著升高62%和16%(P<0.05)。這可能是因為肽段在胃蛋白酶的作用下持續(xù)水解，分子質(zhì)量變小，一些疏水性基團暴露出來，增強了與油的結(jié)合能力，從而提高多肽乳化性[19]。在添加胰蛋白酶后，EAI和ESI顯著下降(P<0.05)，但EAI仍保持在80%以上，此時與消化前相比EAI升高了43%，ESI降低了18%?？赡苁且驗殡S著胰蛋白酶的進(jìn)一步作用，小分子肽水解過度，疏水基團暴露過多，打破了形成表面活性層的平衡，降低了乳化性能[13]。總的來說，模擬胃腸消化對香腸肽的乳化活性有一定提高，但不利于乳化穩(wěn)定性。

2.5.2 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽起泡特性的影響

蛋白質(zhì)起泡性與蛋白質(zhì)的分子大小及表面極性基團有關(guān)，分子大小越合適，極性基團越多，起泡性就越高[20]。香腸肽仍以蛋白質(zhì)為主體物質(zhì)，可見其具有一定的乳化性能。由圖6可知，多肽起泡性和泡沫穩(wěn)定性經(jīng)2 h模擬胃消化后顯著升高(P<0.05)，經(jīng)第二階段模擬腸道消化后又顯著降低(P<0.05)，較消化前起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別升高15%和11.7%。在一定酶解范圍內(nèi)，分子質(zhì)量越小溶解性越好，此時更多的肽分子參與液膜的形成，起泡性增強，但肽鏈太短會使泡沫表面黏彈性降低，液膜間作用變?nèi)?，最終導(dǎo)致起泡性隨分子質(zhì)量減小反而下降[14]?？偟膩碚f，香腸多肽經(jīng)模擬胃腸消化后具有較好的起泡特性。

圖5 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽乳化特性的影響
Fig.5 Effects of simulated gastrointestinal digestion on emulsifying properties of peptides extracted from fermented sausages

圖6 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽起泡特性的影響
Fig.6 Effects of simulated gastrointestinal digestion on foaming characteristics of peptides extracted from fermented sausages

2.5.3 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響

由圖7可知，經(jīng)2 h模擬胃消化后，DPPH自由基清除活性增加至74.2%(P<0.05)，這可能是因為在模擬胃消化過程中暴露出更多的疏水性氨基酸側(cè)鏈[8]。再經(jīng)過第二階段模擬腸消化后，DPPH自由基清除活性又顯著下降至57.23%(P<0.05)?？赡苁且驗榻?jīng)胰蛋白酶進(jìn)一步酶解后，部分活性多肽裂解，疏水基團暴露過度，導(dǎo)致抗氧化活性降低[9]。清除超氧陰離子自由基的能力與DPPH自由基清除活性變化相似，經(jīng)胃蛋白酶消化后，清除率從45.5%顯著升高到74.5%，再經(jīng)胰蛋白酶消化后又顯著下降至64.1%(P<0.05)。羥自由基清除活性在2個消化階段均顯著升高(P<0.05)，這與張淼[21]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物經(jīng)體外消化后羥自由基清除能力顯著增加的結(jié)果相似。模擬消化結(jié)束后，F(xiàn)RAP值從0.439顯著增加至0.518(P<0.05)，這可能與酶解液中顯著增多的中性和酸性氨基酸有關(guān)[22]。經(jīng)過模擬胃腸消化，多肽的羥自由基、超氧陰離子自由基清除活性及FRAP值分別升高31.86%、18.6%和0.079(P<0.05)。綜上，發(fā)酵香腸中多肽含有抗氧化活性片段，且其被人體吸收后仍能發(fā)揮較大作用。

圖7 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽抗氧化活性的影響
Fig.7 Effects of simulated gastrointestinal digestion on antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages

2.5.4 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽游離氨基酸的影響

模擬胃腸消化對多肽游離氨基酸含量的影響如表1所示。總體來看，經(jīng)模擬消化后，總游離氨基酸含量從322.146 mg/L顯著增加到389.123 mg/L(P<0.05)，這可能是因為胃蛋白酶和胰蛋白酶破壞了多肽的二級結(jié)構(gòu)，將其水解成更小分子的肽，同時生成大量游離氨基酸[23]。研究表明，氨基酸在抗氧化反應(yīng)中起重要作用，其作為電子供體，能夠直接與自由基結(jié)合，形成有利于發(fā)揮抗氧化活性的構(gòu)象[24]。經(jīng)過2段酶解后，多肽液中Val、Pro、Ala、Leu、Tyr等疏水性氨基酸含量顯著增高(P<0.05)，Arg、Lys等具有金屬離子螯合能力的氨基酸也顯著增多(P<0.05)。

表1 模擬胃腸消化對發(fā)酵香腸肽游離氨基酸組成的影響 單位：mg/L

Table 1 Effects of simulated gastrointestinal digestion on free amino acid composition of peptides extracted from fermented sausages

注：表中小寫字母不同表示同行間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

本試驗探究了多種加工貯存條件及模擬胃腸消化對發(fā)酵牛肉香腸中多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，熱處理對發(fā)酵香腸多肽抗氧化活性無顯著影響；酸性和中性環(huán)境有利于其抗氧化活性的保持；Na+、K+可促進(jìn)多肽的抗氧化活性；長時間室溫貯存不利于多肽抗氧化活性的保持；模擬胃腸消化后疏水性氨基酸增多，多肽抗氧化活性、乳化活性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性增強。發(fā)酵牛肉香腸肽具有較好的抗氧化穩(wěn)定性，這為其合理開發(fā)及有效利用提供理論依據(jù)。