復合改性小米淀粉Pickering乳液負載β-胡蘿卜素性能研究

Pickering乳液由于具有高度環(huán)境相容性、穩(wěn)定性、控制釋放、抗聚集和脂質氧化等優(yōu)勢，在食品、藥品及功能物質遞送體系被廣泛應用，成為當前食品膠體領域的研究熱點和挑戰(zhàn)[1-3]。植物化學成分[β-胡蘿卜素(β-carotene，BC)、維生素E、維生素A、姜黃素、白藜蘆醇、花青素等]在健康食品工業(yè)中具有非常重要的作用，但由于植物提取物大都容易受到空氣、溫度、光、pH值等的影響，而存在揮發(fā)性高、穩(wěn)定性差、水中溶解性低等缺點，使其應用受到限制[4-6]。包埋可將生物活性物質包覆到具有保護作用的壁材中，有助于活性物質的延長釋放、穩(wěn)定性提高、保護或改善生物活性[7-8]。

MAREFATI等[9]利用疏水改性藜麥淀粉穩(wěn)定的Pickering乳狀液能以較高的包封率(80%)包封姜黃素。ABBAS等[10]利用超聲輔助制備單一改性辛烯基琥珀酸(octenyl succinic acid，OSA)淀粉穩(wěn)定納米乳液，并將其用于姜黃素的荷載，發(fā)現超聲輔助處理有利于姜黃素的穩(wěn)定。陳金鳳等[11]研究了玉米淀粉納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液對活性成分的負載，制備得到BC荷載率穩(wěn)定在45.17%的乳液。錢鑫[12]以ε-聚賴氨酸與淀粉納米晶復配作為固體乳化劑成功制備了包埋輔酶Q10的Pickering乳液。MARKU等[13]制備高含油量的淀粉基Pickering乳液，并將其用于水楊酸甲酯的運載。Pickering乳液在封裝生物活性分子，提高活性物質穩(wěn)定性和生物利用度方面具有巨大的潛力。

本文采用OSA疏水改性協(xié)同球磨處理制備復合改性小米淀粉，以其為顆粒乳化劑構建負載BC的Pickering乳液，研究負載BC的Pickering乳液的鹽離子穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、溫度及光照穩(wěn)定性，并通過貯存實驗、被動釋放、體外模擬消化實驗研究BC在乳液中的負載率和保留率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；透析袋(3 500 Da)、胃蛋白酶、脂肪酶、膽鹽、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，上海源葉生物科技股份有限公司；氫氧化鈉、鹽酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Malvern3000激光粒度儀，英國 MALWERN 公司；DS-Fi2多功能生物顯微鏡，日本Nikon儀器有限公司；BSG-250 型光照培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；IKA T18高速分散機，德國IKA儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復合改性小米淀粉的制備

以小米淀粉為原料，參考MAREFATI 等[9]的方法制備OSA小米淀粉(OSA millet starch，OSS)，測定取代度為0.021 8。

取5.0 g OSA小米淀粉和25 mL蒸餾水于球磨罐中，球磨轉速400 r/min，鋼珠150 g，溫度25～32 ℃，球磨處理2 h。球磨完畢后樣品于4 000 r/min離心15 min，冷凍干燥24 h，過100目篩即得復合改性小米淀粉(ball-milled compound modified millet starch，BMS)。

1.3.2 負載BC的Pickering乳液的制備

將BC以1 mg/mL的質量濃度添加到油相中鏈甘油三酯(medium chain triglycerides，MCT)中磁力攪拌過夜，以保證BC在油中進行最大程度溶解，將混合物以14 000 r/min離心10 min去除未溶解的不溶物。通過紫外可見分光光度法測量油相中的BC濃度。

將合適比例的溶有BC的油相和改性淀粉水溶液的水相進行混合，渦旋攪拌30 s至混合均勻，室溫條件下，用高速剪切均質機以20 000 r/min的轉速，乳化2 min(分4次進行，每次處理30 s，間隔60 s)，制備負載BC的Pickering乳液。

1.3.3 BC的含量測定

標準曲線的繪制：稱取10 mg BC，用氯仿定容至100 mL，得標準溶液(0.1 mg/mL)。吸取標準溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL分別置于50 mL容量瓶中，用氯仿定容，得1、2、3、4、5、6 μg/mL的系列標準溶液，以氯仿做空白，在466 nm測吸光值A，以ρ為橫坐標，A為縱坐標，得標準曲線。

油相中BC含量測定：通過向100 mL氯仿中添加1 mL的油相，使用分光光度計在466 nm下測定吸光度，計算BC在MCT中的初始濃度。

乳液中BC含量測定：取200 μL乳液樣品加入1.6 mL氯仿溶劑使用渦旋儀渦旋5 min，使活性成分被充分萃取?；旌衔镆?4 000 r/min離心10 min以去除淀粉顆粒，取1 mL上清液稀釋至10 mL，以氯仿為空白，測定466 nm處吸光度，使用標準曲線將吸光度測量值轉換為BC的濃度。

BC的負載率計算如公式(1)所示：

BC負載率

(1)

1.3.4 Pickering乳液的穩(wěn)定性分析

(1)鹽離子穩(wěn)定性：通過在制備后向乳液中加入不同體積的NaCl來檢查鹽離子對乳液穩(wěn)定性的影響，乳液中NaCl濃度依次設置為0、50、100、150、200 mmol/L，分別在貯存1、24 h觀察乳液外觀和顯微結構，測定乳液粒徑及電位的變化。

(2)pH穩(wěn)定性：通過調節(jié)乳液pH值來檢查pH對乳液穩(wěn)定性的影響，乳液pH依次設置為2、4、6、8、10，分別在貯存1、24 h觀察乳液外觀和顯微結構，測定乳液粒徑及電位的變化。

(3)溫度及光照穩(wěn)定性：將乳液在4、25、37、60 ℃ 避光以及25 ℃光照條件下貯存，期間分別測定多次乳液的粒徑及乳液中BC含量。

1.3.5 Pickering乳液的粒徑及電位測定

乳液的粒徑大小通過馬爾文3000激光粒度儀測量，電位通過馬爾文Nano zs90 Zeta 電位儀測量，粒徑分布以及Zeta電位分別測量3次。

1.3.6 Pickering乳液的顯微結構觀察

將乳液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，用DS-Fi2多功能生物顯微鏡觀測乳液，在放大100倍數下拍照。

1.3.7 BC在乳液中的釋放

在透析袋(3 500 Da)中加入10 mL Pickering乳液，將該透析袋懸浮在1 L蒸餾水中，25 ℃下進行透析釋放。每間隔6 h從按照1.3.3建立的方法測量1次乳液中BC的濃度。每次測量后，透析過程中的水需要重新更換。

1.3.8 體外模擬胃腸消化

模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)的配制：2 mg/mL NaCl、7 mL/L HCl、3.2 mg/mL胃蛋白酶，所有組分用超純水配制。

模擬腸液(simulated intestinal fluid，SIF)的配制：鹽溶液(36.7 mg/mL CaCl2、218.7 mg/mL NaCl，下同)、24 mg/mL脂肪酶(下同)、54 mg/mL膽鹽(下同)、其中鹽溶液用超純水配制，脂肪酶和膽鹽用5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制。

模擬SGF消化：取7.5 mL SGF于37 ℃保溫5 min，加入相同體積的乳液，調整體系pH至2.5，于37 ℃、100 r/min恒溫搖床消化2 h。期間每30 min對乳液進行取樣(200 μL)，并使用前述方法測量乳液中的BC濃度。

模擬SIF消化：將37 ℃預熱好的1.5 mL鹽溶液、3.5 mL膽鹽溶液和2.5 mL脂肪酶液加入到pH調整為7.0的SGF消化液中，在37 ℃、100 r/min消化2 h，期間用0.1 mol/L NaOH維持消化體系pH為7.0。每30 min對乳液進行取樣(200 μL)，并使用前述方法測量乳液中的BC濃度[9, 15]。

1.3.9 數據分析

采用Excel 2019、SPSS 22對數據進行統(tǒng)計及處理，采用OriginPro 9.0繪制圖，圖表中誤差均為標準誤差，所有實驗均進行3次重復實驗。

2 結果與分析

2.1 Pickering乳液的光學顯微結構

BMS和OSS穩(wěn)定的負載及未負載BC的Pickering乳液的微觀結構如圖1所示，乳液液滴外觀均呈現球形，在負載BC之后呈現出黃色。OSS穩(wěn)定的乳液液滴大小不一，且在負載BC之后乳液液滴明顯增大，說明OSS的乳化能力不足，在負載BC后存在一定程度的破乳現象。BMS穩(wěn)定的乳液液滴粒徑較小且大小分布均一，負載BC之后液滴仍保持較為均勻的大小分布。球磨處理使OSA淀粉的乳化能力得到改善，且乳液界面結構穩(wěn)定，在BC的負載能力上表現出更為優(yōu)良的特性[16]。這可能得益于球磨使OSA淀粉糊化，改變了淀粉形態(tài)結構及柔韌性，更有利于界面覆蓋和構象變化以形成致密的界面網絡結構，增強靜電和空間排斥的穩(wěn)定性，從而表現出更加優(yōu)良的乳化性和界面吸附性[16-17]。

A-BMS穩(wěn)定的負載BC的Pickering乳液；B-OSS穩(wěn)定的負載BC的 Pickering乳液；C-BMS穩(wěn)定的未負載BC的Pickering乳液； D-OSS穩(wěn)定的未負載BC的Pickering乳液
圖1 不同顆粒穩(wěn)定的乳液光學顯微鏡圖
Fig.1 Optical microscope image of emulsions stabilized by different particles

2.2 負載BC的Pickering乳液的穩(wěn)定性分析

2.2.1 pH穩(wěn)定性

不同pH條件下乳液的粒徑及電位如圖2所示。乳液在不同pH環(huán)境下無相分離現象，pH 2的乳液粒徑為38.9 μm，隨pH增大，粒徑急劇減小，并在pH 4～10基本維持穩(wěn)定。BMS顆粒與阿拉伯膠、環(huán)糊精、纖維素等生物高聚物穩(wěn)定的Pickering乳液的pH穩(wěn)定性具有相似的結果[18-19]。不同pH的乳液在放置24 h后粒徑僅出現較小程度變化，表明乳液在不同pH環(huán)境下均具有較好的貯存穩(wěn)定性。

不同乳液的電位值均為負值，因為BMS顆粒上的羧基帶負電荷。pH2～6，電位隨pH的增大而顯著減小，可能是由于BMS在堿性條件下制備，淀粉顆粒表面連接了羧基而帶有負電荷，pH在2～6變化，BMS顆粒表面的羧基基團發(fā)生去質子化，增加了油水界面的負電荷數，表現出更低的電位值[20]。

A-粒徑；B-電位
圖2 不同pH對乳液粒徑及電位的影響
Fig.2 Effect of different pH on emulsion particle size and potential

由圖3乳液的光學顯微鏡圖可以看出，pH 2時，乳液中出現了數量較多的大液滴，這可能來源于該pH值下乳液負電荷數最少，影響了BMS顆粒的疏水性，導致其在油水界面的靜電相互作用降低，表現出乳液穩(wěn)定性不足，油滴之間發(fā)生聚結形成緊密堆積的聚合物，乳液粒徑尺寸相對更大[21]。pH 4～10，體系負電荷數明顯增多，導致它們之間更強的靜電排斥，顆粒更容易吸附到油水界面而增加乳液的穩(wěn)定性，從而表現出分布更加均一的乳液光學顯微結構和良好的聚集穩(wěn)定性[2]。

A-pH 2；B-pH 4；C-pH 6；D-pH 8；E-pH 10
圖3 pH對乳液光學顯微結構及粒徑分布的影響
Fig.3 Effect of pH on the optical microstructure and particle size distribution of emulsion

2.2.2 鹽離子穩(wěn)定性

遞送體系可用于不同水平鹽濃度的商業(yè)產品，因此對乳液的鹽離子穩(wěn)定性進行表征具有重要的實際意義。圖4顯示了乳液粒徑及電位的變化，當不存在鹽離子時，乳液粒徑為29.1 μm，隨鹽離子濃度增大，粒徑僅呈現出較小幅度的增大，表明了乳液具備高度的鹽離子穩(wěn)定性。乳液的光學顯微結構如圖5所示，在較高濃度鹽離子的存在下乳液液滴之間出現了一定程度的聚集，表現為乳液粒徑的增大。乳液在24 h后粒徑均較1 h時表現出一定程度的增大，這表明在油相比例為30%時，乳液中存在較多的水相，使得乳液液滴之間相互碰撞的概率較大，在短時間內表現出粒徑的增大。

隨鹽離子的加入乳液電位呈現增大的趨勢，這表明乳液體系負電荷數顯著下降，放置不同時間后電位值基本保持不變，電位增大可能是鹽離子對淀粉酯表面的負電荷產生了靜電屏蔽。乳液在鹽離子存在下出現了輕微的析水現象，可能與電位的變化有關，Na+和帶負電的—COO-互相吸引，使得凈電荷降低，乳液的穩(wěn)定狀態(tài)發(fā)生了改變，從而出現分層[22]。

A-粒徑；B-電位
圖4 鹽離子濃度對乳液粒徑及電位的影響
Fig.4 Influence of salt ion concentration on emulsion particle size and potential

2.2.3 貯藏穩(wěn)定性

不同貯存溫度和光照條件下Pickering乳液在15 d 內粒徑的變化，如圖6所示。貯存在4～37 ℃避光條件下，各組乳液在放置后粒徑僅呈現較小程度的波動。60 ℃避光條件下乳液粒徑在7 d內急劇增大，表明負載BC Pickering乳液在37 ℃以內具有較高的溫度穩(wěn)定性，而溫度繼續(xù)升高至60 ℃，BMS喪失維持界面穩(wěn)定的作用。E組25 ℃光照和B組25 ℃避光貯存，乳液在粒徑上未呈現明顯的差異，說明貯存的光照環(huán)境對乳液的粒徑影響不大。對照組F代表的OSS穩(wěn)定的負載BC Pickering乳液，初始粒徑93.7 μm，在貯存后15 d后粒徑增大到206.0 μm，說明單一改性的淀粉顆粒穩(wěn)定的乳液在荷載BC后貯存過程中容易發(fā)生聚集、絮凝等現象，相比BMS而言不具備優(yōu)良的貯存穩(wěn)定性。

A-鹽離子濃度0 mmol/L；B-鹽離子濃度50 mmol/L；C-鹽離子濃度 100 mmol/L；D-鹽離子濃度150 mmol/L；E-鹽離子濃度220 mmol/L
圖5 鹽離子濃度對乳液光學顯微結構及粒徑分布的影響
Fig.5 Influence of salt ion concentration on the optical microstructure and particle size distribution of emulsion

2.3 BC在Pickering中的穩(wěn)定性

乳液在不同條件貯存后BC負載率的變化如圖7所示，BC在BMS和OSS穩(wěn)定的Pickering乳液中的初始負載率分別為92.92%和82.44%，且各組乳液隨放置時間的延長，BC負載率均發(fā)生了不同程度的下降。60 ℃避光貯存24 h，BC負載率急劇降低到36.72%，降解率達到50%(半衰期)以上。避光環(huán)境下4、25、37 ℃貯存15 d后BC負載率71.71%(4 ℃避光)>62.60%(25 ℃避光)>51.97%(37 ℃避光)，說明低溫環(huán)境更有利于BC的活性保留。貯存相同時間，光照環(huán)境下BC的負載率始終低于避光環(huán)境下的負載率。在25 ℃光照環(huán)境下貯存，OSS穩(wěn)定的Pickering乳液15 d后BC降解率達72%，表明OSS僅對BC的降解起到輕微的保護作用。而BMS穩(wěn)定的Pickering乳液相同貯存條件下BC降解率僅23%，保留率提升了約49%。

A-負載BC的BMS穩(wěn)定Pickering乳液4 ℃避光貯存； B-負載BC的BMS穩(wěn)定Pickering乳液25 ℃避光貯存； C-負載BC的BMS穩(wěn)定Pickering乳液37 ℃避光貯存； D-負載BC的BMS穩(wěn)定Pickering乳液60 ℃避光貯存； E-負載BC的BMS穩(wěn)定Pickering乳液25 ℃光照貯存； F-負載BC的OSS穩(wěn)定Pickering乳液25 ℃光照貯存
圖6 負載BC Pickering乳液的粒徑
Fig.6 Particle size of Pickering emulsion loaded with β-carotene

圖7 不同貯存條件下乳液中BC的含量變化
Fig.7 Changes of β-carotene content in emulsion under different storage conditions

綜上所述，高溫和光照環(huán)境對乳液BC的荷載是不利的，BMS表現出較為優(yōu)良的負載BC的性能，其原理可能是由于BMS可在油滴外部形成更加致密和更厚的界面層，對氧、促氧化劑、自由基等的擴散提供了空間屏蔽作用，在提升乳液貯存穩(wěn)定性的同時，減緩活性物質發(fā)生降解[7, 23]。

2.4 Pickering乳液中BC的釋放

圖8顯示了Pickering乳液在過量水透析過程中BC隨時間變化的累計釋放。在最初的12 h內，BMS穩(wěn)定的乳液中BC釋放量為16.07%，累計釋放長達80 h后，約42.53%的BC從乳液中釋放。作為對照組的OSS穩(wěn)定的Pickering乳液中，BC不同時間釋放量均顯著高于BMS，說明BMS Pickering乳液相較單一改性OSA淀粉Pickering乳液而言，可有效減緩BC釋放速率。

圖8 Pickering乳液中BC的釋放
Fig.8 Release of β-carotene in Pickering emulsion

不同的包封系統(tǒng)對活性物質的封裝效果存在差異，因此也會表現出不同的活性物質釋放速率。王麒[15]的研究中以糖基化蛋白-多酚納米復合物穩(wěn)定Pickering乳液包埋BC和姜黃素，在54 h內2種活性物質釋放量分別達40%和46%。SHMARAKOV等[23]的研究中顯示，約50%姜黃素在8 h內快速地從二氧化硅納米顆粒Pickering乳液中釋放，36 h后釋放量超過80%。綜上，將BMS穩(wěn)定的Pickering乳液與其他包封系統(tǒng)相比，在負載活性物質、降低活性物質釋放速率方面有較為優(yōu)良的潛力。

2.5 模擬體外胃腸消化

BC由于其抗氧化活性，在降低患癌癥和心臟病的風險方面發(fā)揮著重要作用[23-24]。由于BC的水溶性有限、化學不穩(wěn)定性和在人體內的生物利用度低，因此將其納入商業(yè)食品中存在一些挑戰(zhàn)[7]。為了克服這些缺陷，已經開發(fā)了多種類型的遞送系統(tǒng)，研究表明當膳食類胡蘿卜素與脂質一起食用或與脂質賦形劑共同攝入時，可以增強對其吸收[25-26]。因此，確定BC包封對其在模擬消化期間的穩(wěn)定性和保留率是重要的。表1顯示了乳液在模擬消化過程中粒徑的變化，乳液初始D[4,3]和D[3,2]分別為29.0和19.3 μm，在經過SGF后粒徑略微增大，這是由于SGF過程中，較低的pH值和高離子強度導致乳液液滴出現了一定程度的絮凝和聚合等失穩(wěn)現象。SIF是油脂和淀粉消化的主要場所，也是脂溶性功能因子被吸收利用的場所[27]，乳液經SIF后粒徑顯著減小。

乳液在消化過程中，BC從乳液中釋放并與消化液中的膽鹽、游離脂肪酸和甘油單酯等自組裝形成混合膠束或囊泡，繼而被小腸上皮細胞吸收轉運[15,28]。圖9顯示了BC在SGF和SIF中的釋放情況。圖9-A中隨消化時間的延長，BC的釋放量逐漸增大，模擬胃消化2 h后，BC的釋放量增加到35.91%，相較于其在水中的被動釋放而言，釋放速率和釋放量顯著升高。圖9-B反應了BC在SIF階段釋放量的變化，在最初的30 min，約40.0%的BC快速地從乳液中釋放，隨消化延長至2 h后累計釋放量達70.1%，SIF階段的釋放量顯著高于SGF階段。綜合乳液在SGF和SIF階段的粒徑及BC的釋放情況，復合改性小米淀粉Pickering乳液在胃環(huán)境中能較好地包封和保護BC，并且在腸液消化階段有效破壞乳液結構，使BC有效溶出，以促進其在小腸的吸收。

表1 乳液在模擬消化期間粒徑的變化
Table 1 Changes in particle size of emulsion during simulated digestion

A-模擬胃消化；B-模擬腸道消化
圖9 Pickering乳液中BC在模擬胃消化和 模擬腸道消化中的釋放
Fig.9 Release of β-carotene in Pickering emulsion in simulated gastric digestion and simulated intestinal digestion

3 結論

本研究主要對負載BC的淀粉基Pickering乳液pH穩(wěn)定性、鹽離子穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性進行分析，并探究了功能性Pickering乳液在水、模擬胃腸環(huán)境的釋放和保留率。與OSS穩(wěn)定的Pickering乳液相比，疏水改性協(xié)同球磨處理的BMS制備的Pickering乳液具有更加優(yōu)良的pH、鹽離子、貯存穩(wěn)定性。BC在BMS Pickering的初始負載率為92.92%，光照、溫度等不良環(huán)境會導致負載率下降；其最佳貯存條件為4 ℃避光貯存，15 d后可維持71.71%的負載率。相比于，BMS Pickering乳液對BC的負載能力更強，保護效果更好。與其他包封系統(tǒng)相比，BMS在負載活性物質、降低活性物質釋放速率方面有較為優(yōu)良的潛力。