赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程原核微生物群落及理化因子相關(guān)性分析

中國(guó)傳統(tǒng)食醋是指以谷物為主要原料，經(jīng)過多種微生物共同發(fā)酵，再經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間陳釀而成的一種酸性液體調(diào)味料，在中國(guó)已經(jīng)有3 000多年的歷史[1]。按照食醋的醋酸發(fā)酵工藝，可將食醋分為固態(tài)發(fā)酵食醋和液態(tài)發(fā)酵食醋。山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川麩醋、赤水曬醋和天津獨(dú)流醋等中國(guó)傳統(tǒng)谷物醋都是典型的固態(tài)發(fā)酵食醋[2]；固態(tài)發(fā)酵食醋的開放式發(fā)酵、多菌種協(xié)同、長(zhǎng)時(shí)間陳釀、多代謝產(chǎn)物共存的特點(diǎn)賦予了食醋豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)，使食醋具有開胃、抗菌殺菌、抗氧化和減肥等功效[3]。

赤水曬醋是貴州省赤水市生產(chǎn)的一種極具地方特色的優(yōu)質(zhì)食醋產(chǎn)品，其工序繁多、選料考究、品質(zhì)精良，在中國(guó)西南地區(qū)享有盛譽(yù)。傳統(tǒng)的赤水曬醋用中草藥制曲、經(jīng)蒸煮、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵、曬醅、淋醋、陳釀、滅菌等幾十道工序精制而成[4]。目前有眾多的研究者對(duì)“中國(guó)四大名醋”的發(fā)酵機(jī)理、營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味形成和功能作用等各個(gè)方面進(jìn)行了研究，但對(duì)赤水曬醋的研究較少。目前僅有盧葉等[5]研究了赤水曬醋的有機(jī)酸組成，發(fā)現(xiàn)除乙酸外，不揮發(fā)酸中琥珀酸和乳酸的含量最高；石慶疊等[6]從赤水曬醋中篩選了3株醋酸菌，并研究了其發(fā)酵特性，發(fā)現(xiàn)C6菌株能耐9%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇、8 g/L的氯化鈉和40 g/L的乙酸；唐杰等[7]研究了赤水曬醋的香氣成分，從曬醋中共鑒定出39種主要香氣成分；吳震等[8]研究了赤水曬醋生產(chǎn)過程的理化指標(biāo)和功能性指標(biāo)的變化，揭示了發(fā)酵規(guī)律；何銀等[9]、楊新等[10-11]從赤水曬醋中篩選了腐敗微生物并研究了其發(fā)酵特性，主要包括地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、酸居芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等；李榮源等[12]研究了赤水曬醋各生產(chǎn)階段終點(diǎn)的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，其在曬醅階段檢測(cè)到194種真菌和400種細(xì)菌；但目前尚沒有針對(duì)赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程原核微生物群落結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)研究。赤水曬醋醋酸發(fā)酵階段具有開放式和多菌協(xié)同的特點(diǎn)，因此研究赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程原核微生物群落結(jié)構(gòu)變化對(duì)解析赤水曬醋的發(fā)酵機(jī)理及通過微生物調(diào)控技術(shù)改善赤水曬醋的品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋醅樣品，貴州省赤水市某醋廠。

DNA抽提試劑盒，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；瓊脂糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白酶K，上海生物工程有限公司；Premix ET Taq聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-25L262醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；5425R高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；HiSeq測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司；ELx 800酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；QL-901旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取樣方法

采用五點(diǎn)取樣法從貴州省赤水市某醋廠同一生產(chǎn)批次的3個(gè)不同的醋酸發(fā)酵池(A、B、C)中取樣，每隔3天取樣1次，每次取3個(gè)平行樣品，共采集18個(gè)樣品，將樣品置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 DNA提取

取50 g保存于冰箱中的醋醅樣品置于研缽中，添加液氮研磨5 min，然后使用DNA抽提試劑盒提取醋醅內(nèi)含物微生物DNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

通過擴(kuò)增原核微生物16S rRNA V3～V4區(qū)研究醋醅的原核微生物群落結(jié)構(gòu)，采用的上游引物為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3′)，下游引物為806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。對(duì)指定測(cè)序范圍合成帶barcode的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化，構(gòu)建PE文庫(kù)后進(jìn)行Illumina HiSeq 2500平臺(tái)測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.4 理化指標(biāo)的檢測(cè)

總酸、乙醇、還原糖和乳酸含量的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用QIIME 1.9對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用Usearch去除嵌合體序列，并按照97%相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類劃分，選取最豐富序列(most abundant)為OTU代表序列。細(xì)菌采用GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)(http://greengenes.secondgenome.com/)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類注釋。然后根據(jù)注釋結(jié)果，使用R 3.6、Graphpad Prism 7和Canoco 5等軟件進(jìn)行后續(xù)分析繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程中醋醅樣品原核微生物群落的測(cè)序情況見表1，18個(gè)醋醅樣品檢測(cè)到的有效序列數(shù)為41 713～47 029條，總序列數(shù)為794 635條。按97%的相似度對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類劃分，18個(gè)樣品的OTU數(shù)為51～156個(gè)，共有213個(gè)OTU。且OTU數(shù)隨著醋酸發(fā)酵的不斷進(jìn)行而逐漸下降。所有樣品文庫(kù)的覆蓋率均>99.9%，表明樣品中序列沒有被檢測(cè)出的概率極低。將測(cè)序數(shù)據(jù)置于GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，得到各個(gè)樣品中的物種數(shù)，可見物種數(shù)與OTU數(shù)變化趨勢(shì)一致。

根據(jù)97%相似度水平下的OTU信息，采用表征α多樣性的ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)對(duì)樣品微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估[14]，結(jié)果見表1。ACE指數(shù)用于評(píng)估樣本中OTU數(shù)目的多少，指數(shù)越大，表明OTU數(shù)越多；Shannon指數(shù)用于評(píng)估樣本中微生物的多樣性，Shannon指數(shù)越大，群落的多樣性越高。從表1可以看出，赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程醋醅樣品的原核微生物群落OTU數(shù)和多樣性在第0～3天略微上升，在第3～15天逐漸下降。

基于97%相似度的OTU水平繪制的赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程的原核微生物群落稀釋曲線如圖1所示，當(dāng)檢測(cè)到的序列數(shù)>30 000以后，曲線趨于平緩，說明測(cè)序深度較好，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

2.2 原核微生物群落組成分析

由圖2-a可知，赤水曬醋的醋酸發(fā)酵過程中醋醅的原核微生物群落在門水平上可分為變形菌門(Proteobacteria，41.7%)、厚壁菌門(Firmicutes，43.25%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria，14.29%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，0.48%)和放線菌門(Actiobacteria，0.28%)。由圖2-b可知，醋酸發(fā)酵第0天，變形菌門、厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門的總相對(duì)豐度>98%，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，藍(lán)細(xì)菌門的相對(duì)豐度由42.11%下降至1.45%；而厚壁菌門的相對(duì)豐度由15.53%上升至62.43%；變形菌門的相對(duì)豐度由第0天的40.86%上升至第9天的48.83%，然后再下降至第15天的38.19%；擬桿菌門和放線菌門的相對(duì)豐度在第12天即下降至0.1%以下。

表1 醋醅中原核微生物群落α多樣性
Table 1 Alpha diversity of prokaryotic microbial community in Cupei

圖1 醋醅中原核微生物群落稀釋曲線
Fig.1 Rarefaction curve of prokaryotic microbial community in Cupei

a-門水平的組成；b-相對(duì)豐度變化
圖2 原核微生物群落在門水平的組成及相對(duì)豐度變化
Fig.2 The composition and relative abundance changes of the prokaryotic microbial community at the phylum level 注：圖2-a中原核微生物群落在門水平所占的比例為所有 樣品的平均值

如圖3-a所示，18個(gè)醋醅樣品中的原核微生物屬主要為乳桿菌屬(Lactobacillus，33.88%)、醋桿菌屬(Acetobacter，28.19%)、藍(lán)藻細(xì)菌屬(Acaryochloris，14.21%)、醋酸乳桿菌屬(Acetilactobacillus，8.97%)、未分類的紅螺菌屬(Rhodospirillaceae_unclassified，4.84%)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium，1.98%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，1.69%)和葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter，1.23%)。由圖3-b可知，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，乳桿菌屬的相對(duì)豐度由第0天的15.03%上升至第6天的39.30%，然后下降至第15天的23.05%；醋桿菌屬在第0天時(shí)的相對(duì)豐度為0.32%，第3天時(shí)上升至8.85%，第6～12天相對(duì)豐度為43.77%，第15天又下降至32.28%；而醋酸乳桿菌屬和葡糖醋桿菌屬在第0～6天的相對(duì)豐度極低，在第9～15天相對(duì)豐度逐漸上升，到第15天時(shí)，醋酸乳桿菌屬和葡糖醋桿菌屬的相對(duì)豐度分別達(dá)36.78%和4.76%；藍(lán)藻細(xì)菌屬、未分類的紅螺菌屬、農(nóng)桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、未注釋到的菌屬(not_assigned)和黃單胞菌屬(Xanthomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)等菌屬的相對(duì)豐度隨著醋酸發(fā)酵過程的進(jìn)行而下降；李榮源等[12]研究發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵結(jié)束的醋醅中主要的細(xì)菌屬為乳桿菌屬和醋桿菌屬，這可能是數(shù)據(jù)處理方式的區(qū)別導(dǎo)致醋酸乳桿菌屬未被注釋到。另外可以發(fā)現(xiàn)赤水曬醋醋酸發(fā)酵的細(xì)菌群落組成與鎮(zhèn)江香醋[15]、山西老陳醋[16]、涼州熏醋[17]等固態(tài)發(fā)酵食醋的細(xì)菌群落較為相似，而與浙江玫瑰醋[18]和永春老醋[19]等液態(tài)發(fā)酵食醋的細(xì)菌群落有較大差異，這表明醋酸發(fā)酵工藝對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有較大影響。由于醋酸發(fā)酵過程主要是微生物利用乙醇和糖類物質(zhì)生成乙酸和其他有機(jī)酸并產(chǎn)生大量生物熱的過程，前期乳桿菌屬利用原料中的糖類繁殖代謝，相對(duì)豐度升高，隨后由于小分子糖被耗盡以及酸度的升高，乳桿菌屬逐漸死亡，相對(duì)豐度下降；醋桿菌屬前期利用乙醇大量生成乙酸，后期由于乙醇幾乎被耗盡且酸度升高，因此相對(duì)豐度下降；藍(lán)藻細(xì)菌屬、未分類的紅螺菌屬、農(nóng)桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、未注釋到的菌屬和黃單胞菌屬、甲基桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、假單胞菌屬和泛菌屬等菌屬主要來自原料、空氣和生產(chǎn)工具[15]，醋酸發(fā)酵體系的高乙醇、高乙酸和高溫度使其凋亡；而醋酸乳桿菌屬和葡糖醋桿菌屬由于具有耐酸的特性[20-22]，因此在醋酸發(fā)酵后期其相對(duì)豐度逐漸升高。

a-屬水平的組成；b-相對(duì)豐度變化
圖3 原核微生物群落在屬水平的組成及相對(duì)豐度變化
Fig.3 The composition and relative abundance changes of the prokaryotic microbial community at the genus level 注：圖3-a中原核微生物群落在屬水平所占的比例為所有樣品的平均值

2.3 β多樣性分析

基于Bray-Curtis距離算法，以18個(gè)醋醅樣品中的OTU組成為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)(圖4-a)和聚類分析(cluster analysis，CA)(圖4-b)。由圖4-a可以看出第一主坐標(biāo)軸(PCoA1)和第二主坐標(biāo)軸(PCoA2)對(duì)赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程醋醅中的原核微生物群落的解釋度分別為75.9%和15.2%，不同醋醅樣品基本按照發(fā)酵天數(shù)聚在一起，并隨著發(fā)酵時(shí)間在PCoA1上逐漸移動(dòng)。由圖4-b可以將赤水曬醋的醋酸發(fā)酵過程分為3個(gè)階段：發(fā)酵前期(第0～3天)、發(fā)酵中期(第6～12天)和發(fā)酵末期(第15天)；另外平行樣品之間的距離小于不同時(shí)間樣品之間的距離，可以說明平行樣品之間的一致性較好。

a-PCoA；b-CA
圖4 醋醅中原核微生物群落的PCoA及CA
Fig.4 PCoA and CA of prokaryotic microbial community in Cupei

2.4 基礎(chǔ)理化指標(biāo)變化

固態(tài)發(fā)酵食醋醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，乳酸菌將葡萄糖等小分子糖類轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)伴隨著一系列其他生化反應(yīng)的發(fā)生，這些反應(yīng)共同賦予了食醋獨(dú)特的風(fēng)味[23]。從圖5可以看出，乙醇由5.78%下降到0.33%，而總酸由0.61%(以乙酸計(jì))上升至5.35%(以乙酸計(jì))，兩者變化趨勢(shì)基本相反。而乳酸和還原糖含量的變化趨勢(shì)都是先上升后下降，前期麩皮中的部分大分子糖類由于酸水解作用導(dǎo)致還原糖含量上升，隨后由于乳酸菌等微生物利用還原糖轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)而下降；另一方面，前期乳酸菌利用還原糖產(chǎn)生乳酸，但后期醋酸菌等能利用乳酸生成乙偶姻，導(dǎo)致乳酸含量下降[24]。

2.5 相關(guān)性分析

冗余分析(redundancy analysis，RDA)主要反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，環(huán)境因子箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸間的正負(fù)相關(guān)性，箭頭連線的長(zhǎng)度代表著某個(gè)環(huán)境因子與群落分布和種類分布間相關(guān)程度的大小，連線越長(zhǎng)，說有相關(guān)性越大，反之越小。箭頭連線和排序軸的夾角代表著某個(gè)環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性大小，夾角越小，相關(guān)性越高；反之越低[25]。由圖6可知，乳桿菌屬主要與乳酸和還原糖含量呈正相關(guān)，醋桿菌屬、檸檬乳桿菌屬(Limosilactobacillus)、葡糖醋桿菌屬和醋酸乳桿菌屬主要與酸度呈正相關(guān)，而農(nóng)桿菌屬、黃單胞菌屬和甲基桿菌屬等菌屬主要與酸度呈負(fù)相關(guān)，且與乙醇含量呈正相關(guān)。

a-總酸、乙酸；b-還原糖、乳酸
圖5 醋酸發(fā)酵過程理化指標(biāo)變化
Fig.5 Changes in physical and chemical indicators during acetic acid fermentation

圖6 醋酸發(fā)酵過程原核微生物屬與環(huán)境因子的冗余分析
Fig.6 Redundancy analysis of prokaryotic microbial genus and environmental factors during acetic acid fermentation

3 結(jié)論

赤水曬醋醋酸發(fā)酵過程的OTU數(shù)和物種數(shù)均呈先略微上升后下降的趨勢(shì)。原核微生物群落在門水平上可分為變形菌門(41.7%)、厚壁菌門(43.25%)、藍(lán)細(xì)菌門(14.29%)、擬桿菌門(0.48%)和放線菌門(0.28%)；在屬水平上，醋酸乳桿菌屬和葡糖醋桿菌屬的相對(duì)豐度隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行一直上升，乳桿菌屬和醋桿菌屬相對(duì)豐度隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行先上升后下降；藍(lán)藻細(xì)菌屬、未分類的紅螺菌屬、農(nóng)桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等原核微生物屬的相對(duì)豐度隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行呈下降的趨勢(shì)。主坐標(biāo)分析表明：醋醅樣品按照醋酸發(fā)酵天數(shù)聚在一起，并隨著發(fā)酵的進(jìn)行在第一主坐標(biāo)軸上移動(dòng)；通過聚類分析可將醋酸發(fā)酵過程分為前期(第0～3天)、中期(第6～12天)和末期(第15天)這3個(gè)階段?？偹嵊?.61%(以乙酸計(jì))上升至5.35%(以乙酸計(jì))，乙醇由5.78%下降至0.33%；還原糖和乳酸含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。此外，相關(guān)性分析表明乳桿菌屬主要與乳酸和還原糖含量呈正相關(guān)，醋桿菌屬、檸檬乳桿菌屬、葡糖醋桿菌屬和醋酸乳桿菌屬主要與酸度呈正相關(guān)，而農(nóng)桿菌屬、黃單胞菌屬和甲基桿菌屬等菌屬主要與酸度呈負(fù)相關(guān)，且與乙醇含量呈正相關(guān)。