氨基酸/溫度對OSβG膠束形成及穩(wěn)定性的交互影響

為解決功能性疏水物質(zhì)水溶性低、生物活性發(fā)揮受限等難題，兩親性聚合物自聚集形成的具有疏水核-親水殼結(jié)構(gòu)的納米膠束材料應(yīng)運而生[1]。從頭合成的兩親性聚合物材料在食品應(yīng)用中可能存在安全性問題，適度疏水改性的天然多糖材料因其較高的安全性、良好的生物相容性和可降解性而備受食品工業(yè)的歡迎并得到廣泛研究。與原多糖材料相比，疏水化天然多糖具有更優(yōu)異的膠體特性、界面特性和營養(yǎng)特性[2]。截至目前，有多種針對天然多糖疏水化改性的方法，但在食品科學與營養(yǎng)學界研究和應(yīng)用最多的仍是辛烯基琥珀酸酐酯化改性。辛烯基琥珀酸淀粉酯安全可靠，可作為食品添加劑在各類食品中按生產(chǎn)需要量適量使用。同時，辛烯基琥珀酸淀粉酯還具有優(yōu)良的乳化、增稠和穩(wěn)定功能，是優(yōu)秀的食品高分子乳化劑、穩(wěn)定劑和包被材料[3-4]。β-葡聚糖是公認的食品功能性碳水化合物，具有抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)血糖和血脂及免疫調(diào)節(jié)等健康效應(yīng)[5]。為拓展其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，辛烯基琥珀酸燕麥β-葡聚糖酯(octenylsuccinate modified oat β-glucan ester，OSβG)被合成，其在水相中能自發(fā)形成殼核結(jié)構(gòu)納米級球形自聚集膠束[6]，該膠束對姜黃素、β-胡蘿卜素等脂溶性食品具有良好的增溶和穩(wěn)定作用[7-8]。

與單純的理論研究體系不同，食品體系的共存物質(zhì)和加工條件對OSβG膠束的形成及特性可能產(chǎn)生不可估計的影響，這是決定OSβG膠束能否在真實食品體系中應(yīng)用的關(guān)鍵所在。目前有關(guān)食品共存成分及加工條件對疏水改性多糖自聚集膠束影響的研究鮮見報道。已有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境溫度[9-10]和氨基酸的存在[11-12]都會對表面活性劑自聚集行為帶來積極或消極的影響。因此，本研究選取7種不同性質(zhì)的氨基酸，開展氨基酸-加工溫度對OSβG膠束形成及特性的交互影響，重點考察氨基酸的荷電情況和親疏水性在不同加工溫度下(25、40、55、70、85 ℃)的影響，以期為OSβG膠束在富含氨基酸食品體系中的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥β-葡聚糖(食品級，純度80%，分子質(zhì)量1.68×105 Da)，張家口一康生物科技有限公司；2-辛烯基琥珀酸酐(97%)、芘試劑(光譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、半胱氨酸(Cys)、丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)，上海阿達瑪斯有限公司；透析袋(分子截流量14 000 Da)，美國聯(lián)合碳化物公司；其他試劑均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA323S電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；T25高速分散機，德國IKA儀器設(shè)備有限公司；GL-16G高速離心機，上海安亭科學儀器廠；Zetasizer Nano ZS 90激光粒度儀，英國Malvern儀器有限公司；PHSJ-3F型pH計，上海雷磁儀器有限公司；Sigma 700全自動表面張力儀，瑞典百歐林科技有限公司；H01-1D數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；F-2500熒光分光光度計，日本株式會社日立制作所。

1.3 實驗方法

1.3.1 OSβG及其膠束的制備方法

OSβG的合成參照文獻[13]的方法，所制備的OSβG取代度為0.018。將0.05 g OSβG分散于20 mL蒸餾水中，加熱至沸2 min，冷卻后定容至20 mL，常溫磁力攪拌24 h，即得透明的OSβG膠束水溶液。

1.3.2 氨基酸-溫度交互處理體系設(shè)計

用30 g/L NaOH和2 mol/L HCl溶液調(diào)整氨基酸溶液(1 mol/L)和OSβG膠束溶液(2.5 mg/mL)pH至6，向OSβG膠束溶液中添加不同種類的氨基酸溶液使得最終溶液中氨基酸的濃度為0.01 mol/L，在不同溫度條件下(25、40、55、70、85 ℃)磁力攪拌3 h，冷卻至常溫后立即測定。

1.3.3 臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)的測定

CMC采用疏水探針芘標記熒光法測定[14]。首先制備OSβG與氨基酸互混溶液[OSβG質(zhì)量濃度(1.2～7.5)×10-4 mg/mL]；取少量芘甲醇溶液(2×10-4 mol/L)于離心管，氮吹去除溶劑后，再向離心管中加入上述OSβG與氨基酸互混溶液10 mL(芘探針濃度6×10-7mol/L)，不同溫度下(25、40、55、70、85 ℃)磁力攪拌處理3 h，冷卻至常溫后測定。熒光測試參數(shù)：激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長360～460 nm，狹縫寬度2.5 nm，通過芘探針的第一(I1)和第三吸收峰(I3)的熒光強度的比值與OSβG濃度的對數(shù)(logCOSβG)作圖，分段線性擬合方法求出OSβG的CMC值。

1.3.4 粒徑、多分散系數(shù)和ζ-電位的測定

采用動態(tài)光散射技術(shù)測定OSβG膠束及其與氨基酸互混溶液的粒徑、多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)和ζ-電位[15]。測試條件：氬離子激光器，波長633 nm，室溫，散射角90°。

1.3.5 表面張力的測定

使用白金板法測定OSβG膠束溶液及其與氨基酸互混溶液的表面張力。在每次測量前，先用乙醇-鹽酸溶液清潔白金板并進行火焰灼燒處理，再用去離子水清洗白金板和玻璃容器2～3次，去除干擾和雜質(zhì)；準確量取25 mL待測溶液于專用的測量杯中，浸潤后測定。

1.4 統(tǒng)計分析方法

所有實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標準偏差表示(n=3)。使用SPSS 22進行顯著性分析(Tukey’s HSD，P<0.05)，采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)評價氨基酸種類和溫度及其互作對OSβG的CMC值及其膠束理化特性的貢獻。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸-溫度對OSβG膠束形成的交互影響

在兩親性聚合物分子自聚集過程中，其單體分子與其自組裝膠束始終處于動力學和熱力學平衡之中[16]。當添加其他組分時或改變環(huán)境溫度時，這種動力學和熱力學平衡將會被打破，表現(xiàn)為其CMC值的變化。因此，CMC值是表征聚合物膠束穩(wěn)定性的基本參數(shù)[11]。本實驗采用高疏水性熒光標記物芘熒光光譜法研究氨基酸與溫度對OSβG的CMC值的交互影響，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，除谷氨酸之外，在添加氨基酸或不添加的情況下，CMC隨溫度的升高呈“U型”變化趨勢，說明55 ℃時OSβG的自聚集傾向最強，主要原因在于：(1)溫度從25 ℃升高至55 ℃的過程中，相比于逐漸增強的布朗運動以及逐漸減弱的氫鍵對OSβG自聚集的抑制作用，OSβG鏈間逐漸增強的疏水相互作用對OSβG自聚集的推動作用更強，從而導致CMC逐漸降低；(2)當溫度從55 ℃增至85 ℃時，雖然OSβG分子間疏水作用力會得到進一步加強，但分子間氫鍵會遭到嚴重破壞，分子的布朗運動會急劇加速，這必然會導致CMC增加。就氨基酸對OSβG自聚集的影響而言，表1表明在任何溫度下添加谷氨酸的樣品均具有最低的CMC值，這可能與pH=6時谷氨酸與OSβG都帶有負電荷，從而產(chǎn)生分子間斥力，推動OSβG膠束的形成有關(guān)?？傮w而言，在55 ℃及以下，谷氨酸在25 ℃導致CMC顯著下降，賴氨酸和半胱氨酸在55 ℃導致CMC下降，但不顯著(P>0.05),其余氨基酸的存在對CMC無顯著影響；而當溫度在70 ℃及以上時，在85 ℃時賴氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和丙氨酸導致CMC顯著上升，其余氨基酸的存在對CMC無顯著影響。25 ℃時谷氨酸導致CMC下降的原因與其帶有負電荷密切相關(guān)。而賴氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和丙氨酸在85 ℃時導致CMC顯著升高的原因是：(1)賴氨酸為堿性氨基酸，在pH=6時其側(cè)鏈質(zhì)子化、帶正電荷，在高溫的協(xié)作下更不利于OSβG分子的自聚集；(2)苯丙氨酸、半胱氨酸和丙氨酸為疏水性氨基酸，其與OSβG的游離辛烯基琥珀酸鏈存在較強的疏水作用力，但OSβG分子間及其與氨基酸側(cè)鏈間的氫鍵被嚴重破壞，使得難以維持穩(wěn)定的膠束親水殼結(jié)構(gòu)[17]；(3)此時異亮氨酸對CMC的增加效應(yīng)不顯著，主要原因在于異亮氨酸的疏水性更強，一定程度上彌補了上述不利作用。同樣地，帶有正電荷的賴氨酸對CMC的提升幅度不及帶有負電荷的谷氨酸對CMC的降低幅度，這可能是賴氨酸[(CH2)4]比谷氨酸[(CH2)2]具有較大的疏水鏈段，與OSβG分子之間具有更強的疏水相互作用。

此外，較低CMC值通常標志著膠束具有較好的動力學和熱力學穩(wěn)定性。因此，根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以得出：(1)在25 ℃，谷氨酸可以提升OSβG膠束的穩(wěn)定，對其他溫度下膠束穩(wěn)定性的影響不顯著；(2)在40～70 ℃，除個別情況下膠束穩(wěn)定性略有降低之外，大多數(shù)情況下氨基酸對膠束的穩(wěn)定性影響不顯著；(3)在85 ℃，谷氨酸、異亮氨酸和絲氨酸對膠束穩(wěn)定性影響不顯著，其他氨基酸會導致膠束穩(wěn)定性顯著下降。這些變化與膠束親疏水鏈性質(zhì)、氨基酸的性質(zhì)以及環(huán)境條件密切相關(guān)[18-19]，可能涉及到氨基酸與OSβG親疏水鏈間相互作用(氫鍵、疏水相互作用及靜電斥力)變化以及這些作用力受溫度的影響[17]。后續(xù)理化實驗中所采用的OSβG濃度均高于其在不同種類氨基酸和溫度條件下的CMC值，以保證OSβG能形成膠束。

表1 氨基酸對不同溫度下OSβG的CMC的影響
Table 1 Effects of amino acids on the CMC of OSβG under different temperatures

注：同行中帶有不同上標大寫字母的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)；同列中帶有不同上標小寫字母的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 氨基酸-溫度對OSβG膠束粒徑及其分布的交互影響

通過觀察一定條件下聚合物膠束粒徑及其分布的變化情況可以了解膠束體系的穩(wěn)定性。由表2和表3可知，在任一溫度條件下，與對照或其他氨基酸相比，添加谷氨酸的樣品OSβG膠束的粒徑均最小，即膠束發(fā)生明顯收縮，其主要原因一方面可能是在谷氨酸的靜電排斥下，OSβG更易發(fā)生膠束化并導致參與每個膠束形成的OSβG分子減少；另一方面可能是因為來自谷氨酸的靜電斥力使膠束內(nèi)OSβG分子鏈之間排列更加緊湊。從總的趨勢來看，未添加和添加氨基酸OSβG膠束的粒徑隨著溫度的升高呈“拋物線型”變化趨勢，而除添加谷氨酸外的PDI變化趨勢呈“U型”，其峰值和谷值大多出現(xiàn)在55 ℃。溫度從25 ℃增至55 ℃時膠束粒徑增大，可能主要是升溫導致維持膠束親水性外殼(往往比疏水性內(nèi)核具有更大尺寸)的OSβG親水鏈之間氫鍵作用降低，從而使膠束變得更加松散[17]；而溫度從55 ℃增至85 ℃，膠束粒徑減小，一方面可能是由于溫度會使CMC增大，使參與膠束形成的OSβG分子數(shù)量減少，另一方面可能是溫度提升了OSβG疏水鏈間的疏水相互作用，從而使膠束變得更加緊湊。就氨基酸-溫度對OSβG膠束粒徑的交互影響而言，除谷氨酸在大多數(shù)溫度下均能顯著降低粒徑之外，其他氨基酸與溫度之間沒有明顯的規(guī)律可循，這也就說明氨基酸-溫度對膠束粒徑的影響受多種因素和機制的控制，在不同氨基酸-溫度組合條件下，影響粒徑的各種分子間相互作用(如OSβG之間以及OSβG和氨基酸之間的氫鍵、疏水相互作用等)變化不一[20]。通過關(guān)聯(lián)表2和表3數(shù)據(jù)可知，膠束PDI的變化趨勢與膠束粒徑的變化趨勢密切相關(guān)，一般來說，增大膠束的粒徑往往伴隨著PDI的增大。

表2 氨基酸/溫度對OSβG膠束粒徑的交互影響
Table 2 Interactive effects of amino acid and temperature on the size of OSβG micelles

表3 氨基酸/溫度對OSβG膠束PDI的交互影響
Table 3 Interactive effects of amino acid and temperature on PDI of OSβG micelles

2.3 氨基酸-溫度對OSβG膠束ζ-電位的交互影響

ζ-電位是膠束表面電荷密度的表征，其決定了相鄰膠束粒子之間的排斥程度，是保證膠束粒子完整性、穩(wěn)定膠束粒子、防止膠束粒子合并的主要作用力[21]。氨基酸/溫度對OSβG膠束ζ-電位的交互影響見表4。

表4 氨基酸/溫度對OSβG膠束ζ-電位的交互影響
Table 4 Interactive effects of amino acid and temperature on the ζ-potential of OSβG micelles

總體來看，OSβG膠束始終具有負的ζ-電位，這與pH=6時OSβG分子中辛烯基琥珀酸鏈上的羧基(pKa≈4.2)發(fā)生脫質(zhì)子化現(xiàn)象直接相關(guān)[22]。在不添加氨基酸的情況下，除55 ℃外，溫度變化對OSβG膠束ζ-電位沒有顯著影響。在不同溫度下，各種氨基酸對OSβG膠束ζ-電位影響規(guī)律不同，可基本分為以下3種情況：(1)在25 ℃-谷氨酸、70 ℃-半胱氨酸和80 ℃-半胱氨酸組合條件下，OSβG膠束ζ-電位絕對值顯著降低，最小值(-3.3 mV)出現(xiàn)在25 ℃-谷氨酸，這表示膠束粒子之間的斥力減小，膠束的穩(wěn)定性弱化[21]；(2)丙氨酸在任何溫度下，絲氨酸在低于55 ℃時，賴氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸在25 ℃會導致OSβG膠束ζ-電位絕對值顯著升高，從而提升膠束的穩(wěn)定性，但在相同溫度下，這些升高量在氨基酸種類之間沒有顯著差異。(3)在其他氨基酸/溫度組合條件下，OSβG膠束ζ-電位絕對值都無顯著變化。這充分說明，OSβG膠束ζ-電位絕對值受到氨基酸種類及環(huán)境溫度的雙重調(diào)節(jié)，較低溫度(25 ℃)及較小分子的氨基酸(丙氨酸、絲氨酸)對OSβG膠束ζ-電位的總體影響更大[12]。

2.4 氨基酸-溫度對OSβG膠束溶液表面張力的交互影響

濃度在CMC以上，兩親性聚合物分散體系往往是游離單分子與自聚集共存的動態(tài)平衡體系[23]。分散液中未參與聚集的聚合物分子可能以單分子或不完整膠束形式分布在分散液與空氣接觸的界面上，從而改變分散液的表面張力。這類不完整膠束也被稱為“界面膠束”，類似于半球結(jié)構(gòu)，其與溶液中的具有完整球形結(jié)構(gòu)的“本體膠束”不同[24-25]。一般來說，兩親性聚合物形成膠束的傾向越弱或形成的膠束越不穩(wěn)定，其占據(jù)氣液界面的分子及界面膠束就越多，分散液的表面張力就越低。因此評價兩親性聚合物膠束分散液的表面張力也在一定程度反映其膠束的形成與穩(wěn)定狀況[26]。氨基酸/溫度對OSβG膠束分散液表面張力的交互影響見表5。

表5 氨基酸/溫度對OSβG膠束溶液表面張力的交互影響
Table 5 Interactive effects of amino acid and temperature on the surface tension of OSβG micelles solutions

未添加氨基酸的OSβG膠束溶液的表面張力隨著溫度的增加總體上呈降低趨勢，說明隨著溫度的增加OSβG膠束溶液中的游離疏水鏈傾向于在空氣-緩沖液界面處形成規(guī)則的排列和分布，這主要是因為升溫加劇了溶液內(nèi)部未定位和游離的辛烯基琥珀酸鏈的分子運動，使其更易在界面堆積而形成“界面膠束”。在不同氨基酸下，溫度對表面張力的影響規(guī)律各異，可基本分為以下3種情況：(1)添加賴氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和丙氨酸的OSβG膠束表面張力隨溫度的升高而逐漸降低，說明升溫過程中這些氨基酸的疏水鏈段能促進溶液中游離的疏水鏈向界面轉(zhuǎn)移；(2)添加谷氨酸和絲氨酸時，表面張力變化趨勢呈“拋物線型”；(3)異亮氨酸變化較為復雜，但總趨勢是降低的。表5表明在85 ℃下任何氨基酸樣品均具有最低的表面張力，這可能與高溫加劇溶液中游離的疏水鏈段向界面的遷移相關(guān)。這均說明OSβG膠束表面張力與氨基酸的性質(zhì)及所處溫度密切相關(guān)，可能受分子間作用力及位阻效應(yīng)的調(diào)節(jié)[27-28]。

2.5 氨基酸種類及溫度變化對OSβG膠束各性能影響的貢獻分析

上述研究已充分表明氨基酸種類和溫度變化對OSβG膠束會產(chǎn)生明顯的影響，但2個因素影響的相對強弱以及他們之間是否存在交互作用尚不清楚。鑒于此，利用雙因素方差分析對此進行了評價，結(jié)果見表6。

表6 氨基酸種類及溫度對OSβG的膠束特性貢獻
Table 6 Contribution of amino acid type and temperature on the micellarproperties of OSβG micelles

注：*表示在P<0.05水平上顯著

由表6可知，氨基酸種類和溫度對OSβG膠束所有特性參數(shù)都有顯著影響。根據(jù)F值可以得出，對ζ-電位的影響氨基酸種類強于溫度變化；對其他指標的影響溫度均明顯強于氨基酸種類。溫度對表面張力的貢獻遠大于氨基酸，且二者互作影響顯著。此外，除了氨基酸的酸堿性和親疏水性及其取向性，氨基酸自身的溶解性也對表面活性劑的自聚集有一定的影響[29]。氨基酸種類與溫度對OSβG膠束各特性均表現(xiàn)出顯著的互作效應(yīng)，但互作效應(yīng)的強度都不及各因素單獨的作用。

3 結(jié)論

研究了氨基酸(谷氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸)和溫度(25、40、55、70、85 ℃)對OSβG分子自聚集行為的交互影響，通過測定OSβG形成膠束的CMC、OSβG膠束的粒徑、PDI、表面電荷和表面張力等理化指標，明確了這7種氨基酸及其所處溫度條件影響OSβG自聚集行為的初步機制。結(jié)果表明：(1)隨著溫度的升高，添加谷氨酸OSβG膠束化的CMC呈現(xiàn)遞增趨勢，其余氨基酸及對照OSβG膠束化的CMC變化趨勢均呈“U型”，其峰值總體上位于55 ℃；(2)隨著溫度的升高，各氨基酸及對照OSβG膠束的粒徑變化趨勢呈“拋物線型”，其峰值總體上位于55 ℃；(3)隨著溫度的升高，各氨基酸(除谷氨酸)及對照OSβG膠束的ζ-電位絕對值總體變化趨勢呈“U型”，其峰值總體上位于55 ℃；(4)隨著溫度的升高，多數(shù)氨基酸及對照OSβG膠束溶液的表面張力總體呈現(xiàn)降低趨勢。主要原因在于谷氨酸主要通過靜電作用力、其余各氨基酸主要通過氫鍵和疏水作用力影響OSβG膠束的親水殼和疏水核結(jié)構(gòu)及其緊湊性，而溫度主要以相反的方式影響OSβG分子間及其與氨基酸側(cè)鏈間的氫鍵和疏水作用力，進而共同影響OSβG膠束的聚集結(jié)構(gòu)及其特性。氨基酸的荷電狀況或親疏水性并非其影響OSβG膠束結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用特性的唯一因子，還與氨基酸側(cè)鏈鏈長、極性、空間位阻效應(yīng)及其本身水溶性等因素有關(guān)，同時更受到所處環(huán)境溫度因子的調(diào)控。但還需要進一步從氨基酸(同種氨基酸不同形式——非離子、陰離子、陽離子或兩性離子視角)和OSβG(膠束化動力學和熱力學過程視角)深入研究氨基酸-溫度對OSβG自聚集的交互影響?？傊?，選擇氨基酸作為食品組分代表物，研究氨基酸-加工溫度交互影響OSβG自聚集行為的本質(zhì)規(guī)律，旨在揭示氨基酸-溫度對OSβG分子自聚集形成膠束的促進或阻礙效應(yīng)，最終為構(gòu)建“可控制備、穩(wěn)定和可調(diào)控”的OSβG膠束在富含氨基酸類食品中的加工和應(yīng)用提供新的策略。