動態(tài)高壓微射流處理對低鹽肌原纖維蛋白溶解度和結(jié)構(gòu)的影響

肌原纖維蛋白屬于鹽溶性蛋白，在低鹽(<0.3 mol/L NaCl/KCl)及水溶液條件下蛋白溶解度差[1]，易聚集成纖維絲，將功能基團掩埋于內(nèi)部，因此表現(xiàn)出較差的理化和功能特性[2]，限制了其加工利用程度，特別是在流體類、蛋白飲品類研究中少見[3-4]，市場上也未見商品化的成品。目前改善低鹽條件下肌原纖維蛋白的溶解度主要有糖基化法[5-6]、氨基酸增溶法[7-9]、超聲波法[10-11]、高壓均質(zhì)法等[12-13]。動態(tài)高壓微射流(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是近幾年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，在改性大分子方面具有顯著的效果[14-15]。其原理是在高壓的作用下，液體物料獲得一個很高的動能，經(jīng)過分流后，細流以更高的速度在反應(yīng)腔發(fā)生對擊，其中的大分子同時受到高速撞擊、強烈剪切、高頻震蕩、瞬時壓降等作用，結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)得到改善[16]。相關(guān)研究表明，DHPM能破碎蛋白結(jié)構(gòu)，使粒徑減少，結(jié)構(gòu)改變，溶解度增加，進而提升蛋白的功能特性[17-19]。目前關(guān)于DHPM改性蛋白主要集中在植物蛋白、乳蛋白等[20-21]，對肌原纖維蛋白的研究還未見報道。本實驗主要探討了DHPM壓力和次數(shù)對低鹽肌原纖維蛋白溶解度及其結(jié)構(gòu)的影響，旨在擴大肌原纖維蛋白的應(yīng)用范圍和豐富其產(chǎn)品種類。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞胸肉，湖南省湘佳牧業(yè)股份有限公司；NaCl、NaOH、甲醇、冰醋酸，重慶市鈦新化工有限公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、MgCl2·6H2O、四水酒石酸鉀鈉，上海源葉生物科技有限公司；CuSO4·5H2O，Aladdin；甘氨酸，Macklin；乙二胺四乙酸，Biosharp公司；疊氮化鈉，成都市科龍化工試劑廠，以上皆為分析純。尼羅藍，Adamas公司；熒光白，上海阿拉丁試劑公司；非預(yù)染蛋白Marker 26614(10～200 kDa)，Thermo公司；Tris，biotopped公司；溴酚藍，coolaber公司；牛血清蛋白，Biofroxx公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Tris、考馬斯亮藍R250，上海拓旸生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；SYNERGYH1MG型全波長酶標(biāo)儀，美國基因公司；TGL-16型醫(yī)用冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；MCR302模塊化旋轉(zhuǎn)與界面流變儀，安東帕(上海)商貿(mào)有限公司；ZEN 3690馬爾文粒度分析儀，英國馬爾文公司；M-110EH-30超微量流動態(tài)高壓納米分散儀，加拿大Microfluidics公司；UV—5100紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；DXR2激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Mini-PROTEAN型電泳槽、伯樂電泳儀，美國Bio-Rad公司；LSCM800激光共聚焦顯微鏡 laser scanning confocal microscope，德國卡爾蔡司公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考文獻[22-24]的方法，略作修改：將新鮮雞胸肉清洗干凈，去除膜，并攪碎成肉糜，加入4倍體積的緩沖液A(0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)進行提取，冰水浴勻漿60 s(10 000 r/min)，再離心15 min(4 ℃，8 500 r/min)，重復(fù)離心操作3次，收集沉淀物，即肌原纖維蛋白粗提物。之后將沉淀物分散在4倍體積的冰浴混合液B(0.15 mol/L NaCl，1 mmol/L NaN3，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)中，冰水浴勻漿60 s(6 000 r/min)，離心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，重復(fù)操作2次，收集沉淀物，之后加入8倍體積的緩沖液B(pH 6.25)，勻漿后用3層無菌紗布過濾，之后再進行離心(4 ℃，8 000 r/min，15 min)，所得沉淀即為純的肌原纖維蛋白，置于4 ℃冰箱保存，48 h內(nèi)用完。

1.3.2 DHPM處理

將蛋白分散于磷酸鹽緩沖體系液中(0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4, 0.02%NaN3，pH 7.0)中，冰浴條件下2 800 r/min 均質(zhì)處理30 s，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)參照，采用雙縮脲法測定蛋白含量，并將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至5 mg/mL。將蛋白分散液在8 000 r/min下勻漿1 min，重復(fù)2次；勻漿后的蛋白分別在0、34、69、103、138和172 MPa壓力下DHPM處理9次，以及在138 MPa壓力下DHPM處理0、3、6、9、12次，以上處理均在4 ℃條件下進行。

1.3.3 溶解度的測定

參考梅甜恬等[25]的方法測定。將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至2.0 mg/mL。4 ℃下靜置1 h，離心15 min(12 000×g，4 ℃)。取上清液，用雙縮脲法測定蛋白溶液的濃度，空白用磷酸鹽緩沖液替代。肌原纖維蛋白溶解度計算如公式(1)所示：

溶解度

(1)

1.3.4 表面疏水性的測定

表面疏水性參CHIN等[26]的方法測定，稍作修改。測定蛋白質(zhì)量濃度并將其調(diào)節(jié)至1 mg/mL。取1 mL樣液加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍于離心管中，經(jīng)漩渦(10 min)，離心(8 000×g，10 min)后取上清液0.4 mL，加3.6 mL磷酸鹽緩沖液，振蕩均勻后在波長595 nm處測定吸光值，空白用未添加肌原纖維蛋白的磷酸鹽緩沖液替代。蛋白表面疏水性計算如公式(2)所示：

表面疏水性

(2)

1.3.5 Zeta-粒徑的測定

將樣品蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至0.25 mg/mL，取1 mL稀釋樣品于馬爾文比色皿中，在(25±0.1)℃下以90°的檢測角進行動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)測量微粒的粒徑分布。

1.3.6 激光共聚焦顯微鏡

將蛋白樣品質(zhì)量濃度調(diào)至2 mg/mL，取1 mL稀釋樣品于5 mL離心管中，加入20 μL 0.2%尼羅藍染液(結(jié)合蛋白)和20 μL 0.2%熒光白染液(結(jié)合多糖)，渦旋振蕩混勻，于黑暗處室溫充分反應(yīng)30 min；于載玻片上滴入30 μL染液，蓋上載玻片，用吸水紙吸去周圍多余的液體。分別在激發(fā)波長633和488 nm處觀察蛋白和多糖的大小、分布。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的測定

參考WANG等[27]的方法，稍作修改。在電泳之前，將蛋白質(zhì)樣品(2 mg/mL)以體積比1∶3溶解于SDS-PAGE樣品緩沖液(內(nèi)含10%SDS，50%甘油，0.5%的溴酚藍，0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 6.8)中。將混合物在沸水中加熱6 min。電泳在15 mA下用10%分離凝膠和5%丙烯酰胺堆積凝膠30 min，然后在25 mA下運行90～120 min，之后在染色液(0.1%考馬斯亮藍R-250，45%甲醇，10%冰醋酸)中染色2.5 h，最后在脫色液(10%甲醇，10%冰醋酸)中脫色至條帶清晰為止。

1.3.8 拉曼光譜的測定

將DHPM處理后的樣品凍干，用拉曼光譜測定蛋白的二級結(jié)構(gòu)。激光波長785 nm，功率120 mW，曝光時間60 s，掃描3次，掃描范圍400～3 500 cm-1，測試完成后以苯丙氨酸(1 004 cm-1)為標(biāo)準(zhǔn)進行歸一化。用Perkin Elmer Spectrum對拉曼光譜的吸光度進行處理數(shù)據(jù)調(diào)整、平滑處理。使用Peakfit 4.12進行蛋白質(zhì)酞胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)的分析，依次進行基線校正、Gaussian去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合，根據(jù)各子峰面積計算各個二級結(jié)構(gòu)組成α-螺旋(1 645～1 658 cm-1)；β-折疊(1 665～1 680 cm-1)；β-轉(zhuǎn)角(1 640～1 644 cm-1)；無規(guī)則卷曲(1 660～1 665 cm-1)占總二級結(jié)構(gòu)的比例。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2011進行數(shù)據(jù)計算，SPSS 19.0進行方差分析和顯著性檢驗(P<0.05)，采用Originpro 8.1進行圖像處理。試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白非常重要的理化特性之一，直接影響著蛋白的穩(wěn)定、乳化、凝膠等功能性質(zhì)。較高的蛋白溶解度能表現(xiàn)出更好的產(chǎn)品理化特性，滿足人們期望的食品品質(zhì)要求。如圖1所示，肌原纖維蛋白經(jīng)過DHPM處理后溶解度顯著增加(P<0.05)，當(dāng)處理壓力在103 MPa以內(nèi)時，蛋白溶解度增加迅速(P<0.05)，但當(dāng)DHPM處理壓力在103～172 MPa時，蛋白的溶解度(43.94%～45.65%)增加不再顯著(P>0.05)。隨著DHPM處理次數(shù)的增加(138 MPa)，蛋白溶解度呈顯著增加趨勢(P<0.05)。說明DHPM處理能改善低鹽條件下肌原纖維蛋白的溶解度，這與文獻[17，28-29]的研究一致。

a-DHPM處理壓力；b-DHPM處理次數(shù)
圖1 DHPM處理對肌原纖維蛋白溶解度的影響
Fig.1 Effect of DHPM treatment on solubility of myofibrillar protein 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母 表示差異不顯著(P>0.05)(下同)

2.2 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白Zeta-粒徑的影響

如圖2所示，除34 MPa外，肌原纖維蛋白的Zeta-粒徑隨著DHPM處理壓力和次數(shù)的增加而逐漸減少(P<0.05)。DHPM處理過程中，激流撞擊，使得大聚集體破碎，同時在剪切作用力下，蛋白變成小片段，因此粒徑減少，促進蛋白溶解[2,30]。CHEN等[2]通過原子力顯微鏡觀察到高壓均質(zhì)能使肌原纖維蛋白解聚，產(chǎn)生一些亞微米/納米范圍粒徑的長絲，低聚物和肌球蛋白單體。而在34 MPa(9次)下，蛋白的粒徑顯著增加(P>0.05)，可能的原因是在較低的壓力下蛋白結(jié)構(gòu)松散，展開的蛋白間暴露出基團，相互作用形成大聚合物。FAN等[19]用原子力顯微鏡觀察到食用燕窩蛋白顆粒高度在40 MPa下略有增加，可能是壓力下水進入到分子內(nèi)部。

a-DHPM處理壓力；b-DHPM處理次數(shù)
圖2 DHPM處理對肌原纖維蛋白Zeta-粒徑的影響
Fig.2 The effect of DHPM treatment on the Zeta-particle size of myofibrillar protein

2.3 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

激光共聚焦顯微鏡能直觀地觀測到蛋白在體系中的形態(tài)和分布。肌原纖維蛋白與尼羅藍熒光標(biāo)記物結(jié)合，在激發(fā)波長633 nm處呈紅色。從圖3-a可知，未經(jīng)DHPM處理的蛋白在低鹽下聚集成大顆粒，顆粒間尺寸相差大，在體系中分布也不均勻。如圖3-b所示，在69 MPa DHPM處理下，蛋白大聚集體逐漸消失，變成更小的顆粒。如圖3-c所示，當(dāng)DHPM處理壓力達到138 MPa后，蛋白微粒更加細小、尺寸一致，分布趨于均勻。蛋白微粒變小時，蛋白的比表面積增大，增加了與水的相互作用[31]。

a-未經(jīng)DHPM處理;b-69 MPa下DHPM處理9次; c-138 MPa下DHPM處理9次
圖3 DHPM處理下低鹽肌原纖維蛋白的共聚焦顯微圖
Fig.3 CLSM image of low-salt myofibrillar protein under DHPM treatment

2.4 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白分子質(zhì)量的影響

SDS-PAGE可以對蛋白進行分子質(zhì)量的鑒定，以了解DHPM對蛋白聚集體破碎作用以及蛋白分子質(zhì)量大小的影響(圖4)。

a-DHPM處理壓力;b-DHPM處理次數(shù)
圖4 DHPM處理壓力和次數(shù)對低鹽肌原纖維蛋白 凝膠電泳條帶的影響
Fig.4 Effect of DHPM treatment pressure and times on the bands of low-salt myofibrillar protein gel electrophoresis 注：圖4-a中的a表示未經(jīng)DHPM處理，b、c、d、e、f分別表示 DHPM處理壓力為0、34、69、103、138和172 MPa

從圖4可以看出，未經(jīng)DHPM處理的蛋白在分子質(zhì)量120～150 kDa、75～85 kDa以及接近100 kDa附近有較為明顯的條帶。隨著DHPM處理壓力和處理次數(shù)的增大，分子質(zhì)量為200 kDa以及120～150 kDa附近的蛋白條帶在逐漸消失，而分子質(zhì)量在60～120 kDa的蛋白條帶數(shù)量在逐漸增加，說明蛋白由大分子質(zhì)量向小分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變。這是因為蛋白在強烈的剪切力作用下，蛋白鏈斷裂，形成更多小分子質(zhì)量的蛋白[18,29]。DHPM處理壓力在138 MPa和172 MPa條件下以及DHPM處理次數(shù)在9次和12次條件下，蛋白間的條帶無差別。

2.5 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

從圖5可知，經(jīng)DHPM處理過的肌原纖維蛋白表面疏水性顯著提高(P<0.05)，這是因為DHPM處理能使蛋白的結(jié)構(gòu)展開，暴露出疏水性基團。隨著DHPM處理壓力的增加，蛋白表面疏水性呈現(xiàn)降低的趨勢(P<0.05)，DHPM處理能引起蛋白結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致分子重排[32]。隨著DHPM處理次數(shù)的增加，蛋白表面疏水性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(P<0.05)，這與沙小梅等[33]的研究相似。DHPM處理引起蛋白聚集體展開，暴露出更多的疏水性基團，而隨著DHPM處理次數(shù)進一步增加，解離出的蛋白通過分子表面疏水相互作用等發(fā)生相互作用，促進蛋白進一步折疊，導(dǎo)致表面疏水性基團含量降低[34-35]。

a-DHPM處理壓力；b-DHPM處理次數(shù)
圖5 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白 表面疏水性的影響
Fig.5 Effect of DHPM treatment on surface hydrophobicity of low-salt myofibril protein

2.6 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

拉曼光譜可反映二硫鍵、芳香族和脂肪族殘基、氫鍵和二級結(jié)構(gòu)類型的相對比例的微環(huán)境和相互作用的變化。酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)是蛋白二級結(jié)構(gòu)的特殊表征，并蛋白骨架構(gòu)象類型相關(guān)。從圖6可知，低鹽體系下，肌原纖維蛋白的主要結(jié)構(gòu)是α-螺旋和β-折疊，能占到二級結(jié)構(gòu)的68.22%～79.23%。經(jīng)過DHPM處理后，肌原纖維蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的占比有明顯下降，而無規(guī)則卷曲占比有所增加，說明肌原纖維蛋白由有序向無序態(tài)轉(zhuǎn)變，DHPM使蛋白去折疊，結(jié)構(gòu)展開，這與文獻[30,36]的研究結(jié)果一致。

a-DHPM處理壓力；b-DHPM處理次數(shù)
圖6 DHPM處理對低鹽肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響
Fig.6 Effect of DHPM treatment on secondary structure of low-salt myofibril protein

3 結(jié)論

隨著DHPM處理壓力和次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的溶解度顯著增加(P<0.05)，但當(dāng)壓力達到103 MPa后溶解度的增加不再顯著(P>0.05)；Zeta-粒徑顯著降低(P<0.05)，在172 MPa，9次處理下可降至411.17 nm。激光共聚焦顯微鏡顯示DHPM處理后的蛋白大顆粒消失，尺寸變小、均勻；SDS-PAGE顯示DHPM處理下分子質(zhì)量在200 kDa以及120～150 kDa附近的蛋白條帶在逐漸消失，而分子質(zhì)量在60～120 kDa的蛋白條帶數(shù)量在逐漸增加。經(jīng)過DHPM處理的蛋白表面疏水性顯著增加(P<0.05)，隨著壓力的增加而降低(P<0.05)，隨著次數(shù)的增加先增加后降低(P<0.05)，這是蛋白結(jié)構(gòu)展開又折疊的結(jié)果。經(jīng)過DHPM處理，蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的占比下降，無規(guī)則卷曲占比有所增加。

DHPM能顯著改善肌原纖維蛋白的溶解度，打破聚集的蛋白、降低蛋白粒徑，解聚、尺寸變小的蛋白比表面積增大，增加了蛋白與水的相互作用，促進蛋白的溶解。在DHPM處理下蛋白的高級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能基團暴露，增強了與水相互作用，使低鹽下肌原纖維蛋白的理化特性和功能特性得到改善，以滿足加工要求。