米粉中蛋白組分對(duì)陳化后淀粉顆粒間解聚的影響

中國(guó)是世界稻米產(chǎn)量最高的國(guó)家，平均年產(chǎn)量超過(guò)2億t，占全球的35%[1]。稻米不僅是世界65%以上人口的主食，還可以加工成其他食品。為了保證稻米的周年供應(yīng)，需要對(duì)稻米進(jìn)行儲(chǔ)藏。而稻米儲(chǔ)藏過(guò)程中容易陳化，品質(zhì)發(fā)生劣變，引起經(jīng)濟(jì)損失，但陳化機(jī)制目前仍不清楚。

蛋白質(zhì)和脂肪是大米中最主要的成分，與大米品質(zhì)有著密切關(guān)系[2]。陳化過(guò)程中蛋白質(zhì)含量基本不變，但蛋白質(zhì)中巰基減少，二硫鍵增多，這使得米飯的硬度增大，黏性減小[3-5]。有研究指出，大米中清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白對(duì)淀粉的糊化特性影響不同：添加清蛋白后，淀粉的糊化參數(shù)值均有所提高[6]，而球蛋白的添加卻出現(xiàn)相反的現(xiàn)象[7]；谷蛋白的添加使成糊溫度升高，峰值黏度和衰減值降低[7]；醇溶蛋白的添加導(dǎo)致衰減值增加(P<0.05)[8]。WU等[9]研究發(fā)現(xiàn)大米中的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物會(huì)促使蛋白質(zhì)氧化，引起大米品質(zhì)劣變。越來(lái)越多的研究表明，陳化過(guò)程中蛋白質(zhì)和脂肪的變化是引起大米品質(zhì)變化的最主要原因[10-11]，但證據(jù)仍不充分，特別是陳化中蛋白質(zhì)影響淀粉糊化的途徑仍不明確。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)剝蝕碾磨獲得富含蛋白的米粒外層米粉，然后依次脫脂、脫清蛋白、脫球蛋白、脫谷蛋白和脫醇溶蛋白，將每一組分脫除后所得各樣品進(jìn)行儲(chǔ)藏陳化。以陳化前各對(duì)應(yīng)樣品為對(duì)照，考察各樣品陳化后糊化粒度分布和顯微形態(tài)變化，揭示各蛋白對(duì)淀粉糊化產(chǎn)生影響的微觀機(jī)制，為闡明大米陳化機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

粳型新谷新米，蘇果超市，初始含水量為(14.08±0.07)%。正己烷、NaCl、NaOH、無(wú)水乙醇、鹽酸，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要設(shè)備

JGMJ8090稻谷精米檢測(cè)機(jī)，上海嘉定糧油儀器有限公司；MS2000激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；RVA-TechMaster快速黏度分析儀，瑞典Perten有限公司；LW200CA光學(xué)顯微鏡，上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白脫除及樣品儲(chǔ)藏陳化

利用精米機(jī)對(duì)新米進(jìn)行剝蝕碾磨，獲得米粒外層米粉(碾削質(zhì)量占米粒質(zhì)量的15%，記為F0)，過(guò)40目篩，篩下物裝自封口袋在4 ℃下貯存?zhèn)溆?。為減少脂肪對(duì)脫蛋白的影響，預(yù)先用4倍正己烷在室溫下脫脂1 h，抽濾，自然揮發(fā)殘留溶劑24 h[12]，得脫脂米粉(記為F1)。根據(jù)溶解性差異，參考Osborne經(jīng)典方法，分別選用蒸餾水、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl、0.1 mol/L NaOH和70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇從脫脂米粉中逐一脫除清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白[13-14]，經(jīng)洗滌、中和和凍干后，用研缽碾成粉末，所得各樣品分別記為F2(脫清蛋白樣品)、F3(脫球蛋白樣品)、F4(脫谷蛋白樣品)和F5(脫醇溶蛋白樣品，即粗淀粉)，如圖1所示。

圖1 脫脂脫蛋白流程圖
Fig.1 Flow chart of lipid and protein removal

將米粉及脫脂和脫各蛋白后所得各樣品(F0～F5)分成2份，1份在4 ℃下儲(chǔ)藏保鮮作為對(duì)照，1份在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中儲(chǔ)藏陳化12個(gè)月。

1.3.2 粒度分布的測(cè)定

在試管中加入0.200 g樣品，加10 mL蒸餾水，用渦旋儀使其混勻后靜置5 min，然后置于75 ℃恒溫水浴鍋中加熱5 min(過(guò)高溫度會(huì)黏連成膠凝化狀態(tài))，取出后放置在50 ℃的恒溫水浴鍋中保溫，防止其老化。采用激光粒度分析儀測(cè)定粒度，分析條件：分散劑為水，儀器轉(zhuǎn)速為1 800 r/min，超聲分散，加樣使遮光度達(dá)10%～20%，每個(gè)樣品平行測(cè)定5次，取平均值[15]。

1.3.3 組分陳化效應(yīng)及陳化貢獻(xiàn)率的計(jì)算

大米各組分自身的基質(zhì)效應(yīng)[16]及其在陳化過(guò)程中的變化均會(huì)對(duì)淀粉粒度分布產(chǎn)生影響，排除組分自身的基質(zhì)效應(yīng)，分離出各組分在陳化過(guò)程的變化對(duì)淀粉粒度分布的影響。參照GUO等[12]的方法，計(jì)算脂肪和各蛋白對(duì)陳化后粒度分布的陳化效應(yīng)及各組分的陳化貢獻(xiàn)率。

1.3.4 糊化形態(tài)光鏡觀察

光學(xué)顯微鏡制樣方法與粒度分布相同。觀察時(shí)，先將試管中樣品用渦旋儀混勻1 min，用吸管取樣滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄[10]。

1.3.5 糊化特性的測(cè)定

采用快速黏度分析儀(rapid viscosity analyzer，RVA)并參照美國(guó)谷物化學(xué)家協(xié)會(huì)AACC61-02的方法測(cè)定各樣品的黏度變化。提取RVA譜特征參數(shù)：峰值黏度(peak viscosity，PV)、衰減值(BD)、最終黏度(final viscosity，F(xiàn)V)、回生值(setback，SB)和成糊溫度(paste temperature，PaT)[13]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 8.01進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)及鄧肯多重比較(Duncan’s multiple range test，P<0.05)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫蛋白對(duì)陳化后粒度分布變化的影響

由圖2-A可知，米粉陳化后的粒度分布發(fā)生明顯變化，小粒徑峰降低而大粒徑峰升高。研究表明淀粉單粒粒徑約為3～8 μm[17]，淀粉復(fù)粒約為7～39 μm[18]。圖2-A中小粒徑峰的范圍為2～30 μm，說(shuō)明米粉糊化后出現(xiàn)的小粒徑峰是由解聚分散出來(lái)的淀粉顆粒形成的，包括淀粉單粒和淀粉復(fù)粒。米粉陳化后小粒徑峰降低，表明陳化使淀粉顆粒間更難于解聚。當(dāng)從米粉中逐一脫除脂肪及清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白后，得到粗淀粉，其陳化后粒度分布與陳化前并無(wú)差異(圖2-A′)，說(shuō)明米粉中脂肪和各蛋白的存在是引起米粉陳化后粒度分布變化的根本原因。

某組分被脫除前后粒度分布的變化，代表該組分對(duì)淀粉顆粒間解聚集的影響。某組分被脫除后進(jìn)行陳化，與該組分被脫除前進(jìn)行陳化之間粒度分布的差異，代表該組分陳化對(duì)淀粉顆粒間解聚集的影響。脂肪和各蛋白對(duì)粒度分布的影響見(jiàn)圖2-B～圖2-F′。圖2-B和圖2-B′表明，不論是否陳化，脫脂后的小粒徑峰均降低，同時(shí)大粒徑峰升高且峰位右移，只是陳化后的變化幅度更大，表明脂肪的存在對(duì)淀粉顆粒間的解聚具有一定促進(jìn)作用。脫除清蛋白使陳化前的小粒徑峰明顯增大，同時(shí)大粒徑峰消失(圖2-C、圖2-C′)，但陳化后的小粒徑峰在一定程度上變矮變寬，說(shuō)明清蛋白的存在對(duì)陳化后淀粉顆粒間的解聚具有顯著的抑制作用。脫除球蛋白對(duì)未陳化樣品的粒度分布沒(méi)有影響，但陳化后的脫球蛋白樣品比脫除前的小粒徑峰變得高而窄(圖2-D、圖2-D′)。脫谷蛋白和脫醇溶蛋白對(duì)粒度分布影響不大，且陳化前后基本一致，只是峰位粒徑略有提高(圖2-E、圖2-F′)。這些表明，球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白對(duì)淀粉顆粒間的解聚影響不大，只是略微影響了淀粉顆粒的溶脹。

A～F-米粉及其依次脫脂、脫清蛋白、脫球蛋白、脫谷蛋白和脫醇溶蛋白樣品，未陳化； A′～F′-米粉及其依次脫脂、脫清蛋白、脫球蛋白、脫谷蛋白和脫醇溶蛋白樣品，陳化(下同)
圖2 米粉中脂肪和各蛋白對(duì)淀粉糊化粒度分布的影響
Fig.2 Effect of lipid and proteins in rice flour on particle size distribution of starch in residue during heating

上述結(jié)果說(shuō)明，米粉中的脂肪和清蛋白明顯影響了淀粉顆粒間的解聚，而且這種影響在陳化后增大。但各組分對(duì)米粉陳化后淀粉顆粒間解聚變化的貢獻(xiàn)程度需進(jìn)一步分析。脂肪和各蛋白對(duì)糊化粒度體積分?jǐn)?shù)的影響見(jiàn)表1。脫脂使得小粒徑峰體積分?jǐn)?shù)明顯減小，而脫清蛋白使小粒徑峰體積分?jǐn)?shù)明顯增大，而且后者增大的幅度遠(yuǎn)大于前者減小的幅度，表明了清蛋白的存在對(duì)抑制淀粉顆粒間的解聚作用遠(yuǎn)超過(guò)了脂肪存在時(shí)對(duì)淀粉顆粒間解聚的促進(jìn)作用。而脫球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白對(duì)小粒徑峰體積分?jǐn)?shù)沒(méi)有明顯影響。因此，米粉儲(chǔ)藏陳化后淀粉顆粒間解聚集的變化主要由脂肪的促進(jìn)解聚作用和清蛋白的抑制解聚作用決定，且后者遠(yuǎn)超過(guò)前者，清蛋白被脫除后淀粉顆粒間完全解聚。

表1 米粉中脂肪和各蛋白對(duì)淀粉糊化粒度體積分?jǐn)?shù)的影響
Table 1 Effect of lipid and proteins in rice flour on particle size volume fraction of starch in residue during heating

注：同列不同小寫(xiě)字母表示樣品間差異顯著(P<0.05)(表2同)

但脂肪和清蛋白對(duì)米粉陳化后淀粉顆粒間解聚集的貢獻(xiàn)程度，需要在排除各組分自身對(duì)淀粉顆粒解聚集的基質(zhì)效應(yīng)基礎(chǔ)上分離出來(lái)[12]，見(jiàn)表2。清蛋白對(duì)米粉陳化后淀粉顆粒間解聚影響的陳化貢獻(xiàn)率最大，為118%，而脂肪陳化貢獻(xiàn)率為-18%，更加明確了清蛋白對(duì)淀粉顆粒間解聚集的顯著抑制作用，而脂肪則對(duì)陳化后淀粉顆粒間的解聚具有一定促進(jìn)作用。球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白對(duì)淀粉顆粒間解聚的陳化貢獻(xiàn)率均為0。因此，米粉中淀粉顆粒間難于解聚，關(guān)鍵在于清蛋白，陳化后這種影響更加明顯。

表2 大米陳化過(guò)程中各組分的陳化效應(yīng)及陳化貢獻(xiàn)率
Table 2 Aging effect and contribution rate of each component in rice aging

2.2 脫蛋白對(duì)陳化后光學(xué)顯微形態(tài)的影響

米粉及其脫脂、脫各蛋白前后樣品在陳化前后的糊化形態(tài)如圖3所示。

米粉陳化后仍有很多大顆粒保留，淀粉顆粒間解聚程度比陳化前明顯降低(圖3-A、圖3-A′)，體現(xiàn)出陳化使淀粉顆粒間難于解聚。米粉脫脂后未陳化時(shí)，保留下來(lái)的顆粒比脫脂前大(圖3-A、圖3-B)，而米粉脫脂并陳化后可見(jiàn)更大的顆粒存在(圖3-A′、圖3-B′)，說(shuō)明脂肪的存在有助于糊化中淀粉顆粒間的解聚，進(jìn)而分散成更小的顆粒；而且仍然是陳化后比陳化前的顆粒更大(圖3-B、圖3-B′)，這與粒度分析結(jié)果相一致。而脫清蛋白后，不論是否經(jīng)過(guò)陳化，未見(jiàn)大顆粒保留，淀粉顆粒間解聚較完全(圖3-C、圖3-C′)，這也印證了粒度分析結(jié)果，即脫除清蛋白后大粒徑峰完全消失。

圖3 脂肪和各蛋白對(duì)淀粉糊化光學(xué)顯微形態(tài)的影響
Fig.3 Effects of lipid and proteins on microscopic morphology of starch in residues during heating

脫除球蛋白后，不管陳化前后，在形態(tài)上均無(wú)明顯變化(圖3-D、圖3-D′)。脫谷蛋白和脫醇溶蛋白的樣品陳化后形態(tài)變化也不明顯，見(jiàn)圖3-E～圖3-F′，可以清晰地看出，脫除谷蛋白和醇溶蛋白后，不論陳化前還是陳化后，淀粉顆粒間已完全解聚，彼此間呈分散狀態(tài)。這些結(jié)果都與粒度分布的結(jié)果高度一致，表明儲(chǔ)前脫除清蛋白即可使淀粉顆粒間完全解聚，米粉陳化中清蛋白的存在是造成陳化后淀粉顆粒間難于解聚的主要原因，這可能對(duì)改善米制品的品質(zhì)具有重要意義。

2.3 脫蛋白對(duì)陳化后糊化特性的影響

儲(chǔ)前脫脂和脫清蛋白對(duì)陳化后糊化特性的影響見(jiàn)表3。陳化后，米粉的PV明顯降低，脫脂并沒(méi)有改變這種變化趨勢(shì)，然而脫清蛋白并陳化后PV卻明顯提高，說(shuō)明脫清蛋白后淀粉顆粒間解聚有助于峰值黏度的提高。米粉陳化后BD值明顯降低，脫脂不但沒(méi)有改變降低的趨勢(shì)，而且降低的幅度更大，而脫清蛋白并陳化后BD降低的幅度明顯減小，表明脫清蛋白后淀粉顆粒間解聚促進(jìn)了淀粉顆粒的溶脹和破裂，脫清蛋白使得陳化后FV和SB的增加幅度降低也說(shuō)明了這一點(diǎn)。特別是PaT，米粉陳化后提高了9.47 ℃，脫脂米粉陳化后提高了2.10 ℃，而脫清蛋白樣品陳化后與陳化前無(wú)明顯提高，這充分說(shuō)明脫清蛋白后淀粉顆粒間解聚有助于成糊溫度的降低。另外，與脫脂米粉(脫清蛋白前)陳化后相比，脫清蛋白樣品陳化后PV、BD明顯提高，PaT明顯降低。這些結(jié)果都表明，脫清蛋白使得陳化后的糊化特性得到明顯改善。

表3 脂肪和清蛋白對(duì)糊化特性的影響
Table 3 Effects of lipid and albumin on starch pasting properties

注：同行不同小寫(xiě)字母表示樣品間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

儲(chǔ)前脫除米粉中脂肪和各蛋白，將所得樣品進(jìn)行陳化。糊化后粒度分析表明，陳化中清蛋白的存在明顯抑制了淀粉顆粒間的解聚，而脂肪的存在則在一定程度對(duì)淀粉顆粒間解聚具有促進(jìn)作用，這2種組分對(duì)米粉陳化后淀粉顆粒間解聚變化的陳化貢獻(xiàn)率分別為118%和-18%，微觀形態(tài)有力地支持了粒度分析結(jié)果。脫清蛋白使得陳化后PV明顯提高，BD降低幅度及FV和SB升高的幅度縮小，PaT降低到與陳化前無(wú)顯著差異(P<0.05)，糊化特性得到明顯改善。因此，米粉中清蛋白的存在使得陳化后淀粉顆粒間難于解聚是米粉陳化后糊化特性變化的主要原因。這一發(fā)現(xiàn)，對(duì)于揭示稻米陳化變化的微觀機(jī)制具有重要意義，對(duì)于調(diào)控米制品品質(zhì)也具有一定的指導(dǎo)作用。