基于UPLC-ESI-TOF-MS技術(shù)的姬松茸和雙孢蘑菇酚化合物定性分析及體外抗氧化活性研究

多酚廣泛存在于植物中，根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可以分為酚酸類、黃酮類、芪類和木酚素等[1]，對人體有抗氧化、抗炎癥、預防肥胖、糖尿病等功效[2]。食用菌中富含多酚，且多以酚酸化合物存在，包括苯甲酸類和黃烷-3-醇類等。姬松茸(Agaricus brasiliensis)又名巴西蘑菇，是蘑菇屬的一種名貴食藥用真菌，其菌肉有杏仁味，營養(yǎng)豐富，含有多糖、甾醇和維生素等營養(yǎng)活性成分，具有較高的抗癌活性和增強免疫的功能[3]。雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)栽培范圍廣、產(chǎn)量大，肉質(zhì)肥美、營養(yǎng)價值高，富含多酚、多糖、氨基酸、礦物質(zhì)等成分，抗過敏、抗腫瘤和抗氧化等作用顯著[4]。

姬松茸和雙孢蘑菇栽培方式相似，作為2種重要的食用菌，關(guān)于其多酚組成已有一些文獻報道。如CARVAJAL等[5]從姬松茸子實體和菌絲體中均分離出沒食子酸、丁香酸和焦性沒食子酸。但現(xiàn)有的文獻均是采用高效液相色譜法對其組成進行鑒定，僅可測得所選的酚化合物標準品是否存在于待測樣品中，而無法全面測得樣品中的酚化合物組成。

本文擬采用超高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-electrospray time- of- flight- mass spectrometry，UPLC-ESI-TOF-MS)對實驗室栽培獲得的姬松茸和雙孢蘑菇子實體中的酚化合物組成進行初步分離鑒定，并對其多酚提取液的DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力和還原力進行測定，綜合評價2種食用菌子實體多酚提取液的體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姬松茸與雙孢蘑菇子實體由本實驗室采用常規(guī)方法栽培獲得。采摘子實體后，除去菇腳的泥土等雜質(zhì)后冷凍干燥，粉碎過80目篩，密封置于冰箱中保存。

沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；福林酚、DPPH、啡咯嗪，北京索萊寶科技有限公司；甲醇(色譜純)，天津市康科德科技有限公司；Na2CO3、乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl2等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV752紫外可見分光光度計，上海赫爾普國際貿(mào)易有限公司；UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)、AcquityTM ultra型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Triple TOF 5600+型飛行時間質(zhì)譜(配有電噴霧離子源)，美國AB SCIEX公司；ZORBAX-SB C18(100 mm×4.6 mm i.d.，1.8 μm)色譜柱,美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多酚的提取

按照CHETHAN等[6]的方法略作改動。分別準確稱取2.00 g子實體粉末，用石油醚(30～60 ℃)脫脂，轉(zhuǎn)移至50 mL的錐形瓶中，分別加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，離心取上清液，將濾渣采用相同方式進行復提，合并2次上清液。將上清液冷凍干燥，用甲醇定容至一定體積，保存至冰箱中待測。

1.3.2 多酚組成的鑒定

液相條件：流動相由0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸乙腈組成，流速0.8 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量5 μL；柱溫箱30 ℃；梯度洗脫程序為：0～2 min，5%B；2～25 min， 5%～35% B；25～35 min，35%～95% B；35～37 min，95% B；37～40 min，95%～5% B；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；流速0.8 mL/min。

質(zhì)譜條件：UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀，由于蘑菇中的酚化合物多為酚酸[7]，解離為陰離子，因此采用負離子掃描模式；掃描范圍：100～1 500 m/z；霧化氣(GS1)：50 psi；霧化氣(GS2)：50 psi；氣簾氣(CUR)：35 psi；離子源溫度(TEM)：550 ℃(負)；離子源電壓(IS)：-4 500 V；一級掃描：去簇電壓(DP)：100 V，聚焦電壓(CE)：10 V；二級掃描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為-20、-40、-60 V，進樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差<2×10-6[8-9]。

1.3.3 多酚提取液體外抗氧化活性的測定

姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液中多酚含量的測定：采用福林酚比色法[10]。以沒食子酸為標準品進行標準曲線的繪制：Y=7.167 1X-0.003 5(R2=0.999 8，X為沒食子酸的濃度，Y為對應濃度下的OD值)。樣品中的多酚含量用每克樣品(干重)中的沒食子酸當量來表示，單位為mg GAE/g DW。

姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液DPPH自由基清除能力的測定[11]：在2 mL不同濃度的樣液中加入2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)，搖勻，靜置30 min，對照用甲醇代替樣品，空白管為樣品加70%的乙醇(即DPPH的溶劑)。517 nm處測OD值。按公式(1)計算DPPH自由基清除能力：

DPPH自由基清除能力

(1)

式中：A0，對照吸光度值；A1，樣品吸光度值；A2，空白吸光度值。

姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液還原力的測定[12]：當溶液中存在還原劑時，F(xiàn)e3+和鐵氰化物復合物會接受還原劑給出的電子轉(zhuǎn)化為Fe2+形式的化合物，進而兩者反應生成普魯士藍(Fe4[Fe(CN)6]3)，其在700 nm處有最強吸收峰，溶液顏色由原來的黃色變成不同程度的綠色-藍色，故測定700 nm處的OD值即可測定Fe2+濃度。OD值越大，表示還原力越強。

測定方法為：在1 mL不同濃度的樣液中分別依次加入2.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)和2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃保溫20 min，然后迅速冷卻，加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為10%三氯乙酸溶液，離心，取上清液。1.25 mL上清液中依次加入1.25 mL蒸餾水和0.25 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min，700 nm處測OD值。

姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液Fe2+螯合能力的測定[13]：在1.6 mL不同濃度的樣液中分別依次加入1.6 mL蒸餾水、0.4 mL 0.5 mmol/L FeCl2、0.4 mL 0.5 mmol/L Ferrozine，然后劇烈搖動1 min，室溫放置20 min后，562 nm處測OD值?？瞻坠?A0)用蒸餾水代替樣液。按公式(2)計算Fe2+螯合能力：

Fe2+螯合能力

(2)

式中：A1，樣品吸光度值，A0，空白吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)3次重復，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，多個均數(shù)間的兩兩比較用Duncan多重比較法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸和雙孢蘑菇子實體中多酚組成的鑒定

姬松茸子實體甲醇提取液經(jīng)過UPLC-ESI-TOF-MS分析后，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，初步鑒定出以下10種酚類物質(zhì)，其一級和二級質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)圖和相關(guān)信息如電子版本中的附圖1和表1所示。

化合物A：[M-H]-為237.089 0，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H14N2O4，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 219[M-18-H]和m/z 193[M-44-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在1個羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為甘氨酰-L-酪氨酸。

表1 姬松茸和雙孢蘑菇酚化合物的信息表
Table 1 Information of phenolic compounds from A.brasiliensis and A.bisporus

化合物B：[M-H]-為264.099 8，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C12H15N3O4，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 246[M-18-H]，m/z 220[M-44-H]和m/z 203[M-44-17-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為β-N-(γ-谷氨酰)-4-甲?；诫?。

化合物C：[M-H]-為294.110 3，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C13H17N3O5，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 276[M-18-H]，m/z 250[M-44-H]和m/z 233[M-44-17-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為甲基戊酸。

化合物D：[M-H]-為219.078 4，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H12N2O3，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 201[M-18-H]和m/z 219[M-28-H]等碎片離子，結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為5-羥基色氨酸。

化合物E：[M-H]-為194.047 2，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C9H9NO4，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 152[M-42-H]和m/z 108[M-42-44-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和羰基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為2-乙酰氨基-3-羥基苯甲酸。

化合物F：[M-H]-為121.031 8，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C7H6O2，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-29-H]等碎片離子，以及Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為4-羥基苯甲醛。

化合物G：[M-H]-為293.079 0，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C13H14N2O6，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 249[M-44-H]和m/z 204[M-45-44-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為acromelic acid E。

化合物H：[M-H]-為241.120 5，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H18N2O4，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 197[M-44-H]和m/z 168[M-44-29-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和羰基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索及大量文獻，推測該化合物為L-焦谷氨酰-L-亮氨酸。

化合物I：[M-H]-為249.089 1，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C12H14N2O4，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 204[M-45-H]和m/z 168[M-58-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在酰胺，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為鄰-丁二酰胺基-苯甲酸甲酯。

化合物J：[M-H]-為275.104 7，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C14H16N2O4，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 231[M-44-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為L-焦谷氨酰-L-苯丙氨酸。

雙孢蘑菇子實體甲醇提取液經(jīng)過UPLC-ESI-TOF-MS分析后，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，初步鑒定出12種酚類物質(zhì)，其中有6種與從姬松茸中分離鑒定的酚化合物一樣，分別為：甘氨酰-L-酪氨酸、β-N-(γ-谷氨酰)-4-甲?；诫?、甲基戊酸、4-羥基苯甲醛、L-焦谷氨酰-L-亮氨酸和L-焦谷氨酰-L-苯丙氨酸。其余6種酚化合物的一級和二級質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)圖和相關(guān)信息如附圖2和表1所示。

化合物a：[M-H]-為257.078 4，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C10H14N2O6，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 239[M-18-H]，m/z 213[M-44-H]和m/z 169[M-44-17-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為5-羥脯氨酰-L-谷氨酸。

化合物b：[M-H]-為153.020 2，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C7H6O4，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 109[M-44-H]和m/z 91[M-44-18-H]等碎片離子，該化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物c：[M-H]-為291.099 1，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C14H16N2O5，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 247[M-44-H]和m/z 230[M-17-44-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為(2R,4R)-2-[(1H-吲哚-3-基)甲基]-4-氨基-2-羥基戊烷-1,5-二酸。

化合物d：[M-H]-為222.077 9，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H13NO4，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-30-H]和[M-30-15-H]等碎片離子，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為環(huán)磷酰胺。

化合物e：[M-H]-為249.099 5，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C11H14N4O3，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 205[M-44-H]和m/z 163[M-42-44-H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為阿樸鳥嘌呤A。

化合物f：[M-H]-為207.078 3，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C10H12N2O3，根據(jù)二級質(zhì)譜m/z 163[M-44-H]，m/z 121[M-44-42-H]和m/z 121[M-44-42-17H]等碎片離子，化合物結(jié)構(gòu)中存在羧基和氨基，結(jié)合Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為犬尿氨酸。

2.2 姬松茸和雙孢蘑菇子實體多酚提取液的體外抗氧化活性

首先測定了姬松茸和雙孢蘑菇子實體中的多酚含量(圖1-a)，結(jié)果顯示姬松茸中的多酚含量顯著高于雙孢蘑菇(P<0.05)，分別為22.21和19.58 mg GAE/g。之后對2種子實體多酚提取液的體外抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、還原力和Fe2+螯合能力)進行了測定。

a-多酚含量；b-DPPH自由基清除能力；c-還原力；d-Fe2+螯合能力
圖1 姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液的多酚含量和體外抗氧化活性
Fig.1 Polyphenols contents and antioxidant properties in vitro of extracts from A.brasiliensis and A.bisporus

從圖1可知，姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液的DPPH自由基清除能力、還原力和Fe2+螯合能力均隨著提取液濃度的提高而逐漸提高。姬松茸和雙孢蘑菇在提取液質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時對DPPH自由基清除能力達到最強，分別為81.09%和72.98%。2種蘑菇子實體提取液質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時，其還原力最強，在此濃度下對Fe2+螯合能力也達到最強，分別為93.02%和88.99%。

為了更好地反映2種子實體的體外抗氧化活性，對各抗氧化指標的EC50值進行了計算，結(jié)果如表2所示。雙孢蘑菇提取液各抗氧化指標的EC50值均顯著高于姬松茸，這說明姬松茸子實體提取液的體外抗氧化活性顯著強于雙孢蘑菇(P<0.05)。

表2 姬松茸和雙孢蘑菇多酚提取液抗氧化活性的EC50值
Table 2 EC50values in antioxidant activities of A.brasiliensis and A.bisporus

3 結(jié)論與討論

本實驗采用UPLC-ESI-TOF-MS對姬松茸和雙孢蘑菇子實體中的酚化合物組成進行了初步分離鑒定，分離到了16種酚化合物，分別為：甘氨酰-L-酪氨酸、β-N-(γ-谷氨酰)-4-甲酰基苯肼、甲基戊酸、5-羥基色氨酸、2-乙酰氨基-3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲醛、acromelic acid E、L-焦谷氨酰-L-亮氨酸、鄰-丁二酰胺基-苯甲酸甲酯、L-焦谷氨酰-L-苯丙氨酸、5-羥脯氨酰-L-谷氨酸、3,4-二羥基苯甲酸、(2R,4R)-2-[(1H-吲哚-3-基)甲基]-4-氨基-2-羥基戊烷-1,5-二酸、環(huán)磷酰胺、阿樸鳥嘌呤A和犬尿氨酸。在這16種酚化合物中，有6種是同時存在于2種食用菌中的。2種蘑菇子實體的多酚含量分別為22.21和19.58 mg GAE/g。并對姬松茸和雙孢蘑菇子實體多酚提取液體外抗氧化性進行了測定，得出姬松茸和雙孢蘑菇子實體提取液的DPPH自由基清除能力、還原力和Fe2+螯合能力均隨著提取液濃度的提高而逐漸提高。且在提取液質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時對DPPH自由基清除能力達到最強，分別為81.09%和72.98%；在提取液質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時，其還原力最強，在此濃度下對Fe2+螯合能力也達到最強，分別為93.02%和88.99%。且通過計算EC50值得出，姬松茸子實體提取液的體外抗氧化活性顯著強于雙孢蘑菇。以上結(jié)果說明姬松茸和雙孢蘑菇具有被開發(fā)為功能食品或添加劑的潛力。

傘菌氨酸(β-N-(γ-谷氨酰)-4-羥甲基苯肼)具有明確的抗腫瘤、治療糖尿病、誘導白血病細胞凋亡等活性作用[14-16]，近年來引起了普遍的關(guān)注。本實驗從姬松茸和雙孢蘑菇子實體中分離到β-N-(γ-谷氨酰)-4-甲?；诫率呛铣蓚憔彼岬闹虚g體[17]。CHULIA等[18]曾報道從四孢蘑菇(Agaricus campestris)的子實體中分離到β-N-(γ-谷氨酰)-4-甲?；诫?，還未發(fā)現(xiàn)從姬松茸和雙孢蘑菇中分離到β-N-(γ-谷氨酰)-4-甲?；诫碌膱髮?。CARVAJAL等[5]報道在姬松茸子實體和菌絲體中均分離到?jīng)]食子酸、丁香酸和焦性沒食子酸，而在本次實驗中均沒有分離到這3種酚酸化合物。研究報道表明4-羥基苯甲酸存在于雙孢蘑菇、糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)、杏鮑菇(Pleurotus eryngi)、香菇(Lentinus edodes)等蘑菇的子實體和菌絲體中[7,19]，YAO等[20]在裂褶菌(Schizophyllum commune)的子實體中也分離到4-羥基苯甲酸。本實驗從姬松茸中也分離到了4-羥基苯甲酸。REIS等[7]曾報道在雙孢蘑菇的菌絲體里發(fā)現(xiàn)有4-羥基苯甲酸，這與本文實驗結(jié)果是一致的。此外，還有文獻報道在姬松茸和雙孢蘑菇的子實體中存在沒食子酸、桂皮酸和焦性沒食子酸[5,19,21-23]，而在本實驗中卻沒有分離到。導致這些結(jié)果差異的原因，可能是由于子實體栽培條件或培養(yǎng)基質(zhì)不同導致的，也可能是由于檢測條件不同所導致的，亦有可能是因為在本次實驗中還未鑒定出來。

很多研究表明多酚含量與抗氧化性具有明確的正相關(guān)性，那酚類物質(zhì)的組成與抗氧化性是什么關(guān)系？REIS等[7]研究分析了雙孢蘑菇、糙皮側(cè)耳、杏鮑菇、香菇的子實體和菌絲體的抗氧化性以及樣品中的酚酸化合物，發(fā)現(xiàn)樣品中的單一酚酸化合物(含量)與抗氧化性之間沒有明確的相關(guān)性，也就是說，某一種高含量的酚酸不一定能導致高的抗氧化性。PALACIOS等[21]的研究結(jié)果也得到了相同的結(jié)論。在本實驗中由于沒有測定分離到酚化合物的絕對含量，所以無法與抗氧化性的相關(guān)性進行分析，具體的結(jié)論還有待進一步的實驗研究。本實驗從姬松茸和雙孢蘑菇中分離到的多種酚化合物具有各自的活性作用，例如4-羥基苯甲酸的抗神經(jīng)衰弱功能[20]和抗炎作用[19]，β-N-(γ-谷氨酰)-4-甲酰基苯肼[或β-N-(γ-谷氨酰)-4-羥甲基苯肼]的抗腫瘤、治療糖尿病等活性作用[14-16]。因此，該研究為雙孢蘑菇和姬松茸開發(fā)成相關(guān)的功能食品或產(chǎn)品提供依據(jù)。