高壓熱殺菌結(jié)合酸對枯草桿菌芽孢的殺滅作用

芽孢通常存在于環(huán)境中，包括食品中，它自身獨特的結(jié)構(gòu)使其對熱、干燥、紫外線和γ輻射等處理以及一些殺菌化學(xué)物質(zhì)具有極強的抵抗力[1-2]，很難被殺滅。由于殺菌強度不夠，芽孢引起的食物腐敗和食物中毒時有發(fā)生[3-4]。高壓熱殺菌(high-pressure thermal sterilization，HPTS)作為一種新型的食品殺菌技術(shù)，可以殺滅食品中所有微生物，包括最難殺死的芽孢[5]，相比于高溫殺菌，HPTS處理過程相對溫和，對食品的感官和營養(yǎng)品質(zhì)的損害較小[6-7]。

近年來，相關(guān)研究致力于HPTS與其他因素相結(jié)合來進一步提高芽孢的致死性，例如降低介質(zhì)的pH，TOLA等[8]報道：隨著介質(zhì)pH值的降低，HPTS殺滅地衣桿菌芽孢的數(shù)量在增加。ROBERTS等[9]發(fā)現(xiàn)pH越低，芽孢的抗性減弱，在400 MPa、45 ℃條件下，當(dāng)pH值從7.0降到4.0時，多殺滅了1.5個對數(shù)的凝結(jié)桿菌芽孢。然而在高壓熱處理過程中，酸度對芽孢失活的影響以及兩者結(jié)合殺滅芽孢的作用機理，目前尚不明確。HPTS主要影響芽孢內(nèi)膜的通透性、膜脂的流動性[10]和芽孢蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)[11]。研究表明，HPTS破壞了芽孢內(nèi)膜對水分子的通透屏障，大量水分子進入芽孢內(nèi)核而導(dǎo)致內(nèi)核水合和芽孢死亡[12-13]，而不同pH值不僅可以改變蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的電荷，還可以改變細胞膜的電荷，從而影響微生物的功能和活性[14]。WUYTACK等[15]研究人員發(fā)現(xiàn)，低pH值會改變氨基酸側(cè)鏈的電離狀態(tài)，從而改變電荷分布和蛋白質(zhì)構(gòu)象。SETLOW等[16]研究表明酸對芽孢的殺滅涉及芽孢通透性屏障的破壞。

傅里葉變換紅外光譜儀目前廣泛應(yīng)用于綜合檢測微生物的生理狀態(tài)[17]，具有高分辨率、高靈敏度和高效掃描等優(yōu)勢，利用該儀器對芽孢紅外光譜中不同波段進行研究，可以分析出HPTS與酸共同作用下芽孢膜脂相態(tài)和蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的變化情況。

本文將HPTS與酸處理相結(jié)合，對枯草桿菌芽孢進行處理，研究HPTS與酸聯(lián)合作用對枯草桿菌芽孢的殺滅效果并探討其殺滅機理，為深入研究芽孢殺菌抗性及HPTS在殺滅細菌芽孢上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號As 1.433；營養(yǎng)瓊脂，天津市大茂化學(xué)試劑廠；促芽孢生長錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，向營養(yǎng)瓊脂中加入MnSO4·H2O(使Mn2+質(zhì)量濃度為 50 mg/L)，調(diào)pH值，滅菌備用；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、TSA-YE培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9000S型雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Scientz-1LS真空冷凍干燥干燥濃縮儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；CyFlow Cube 8流式細胞儀，日本SYSMEX(希森美康)株式會社；5L HPP超高壓設(shè)備，包頭科發(fā)高壓科技有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢懸浮液的制備

將活化的枯草芽孢桿菌(As 1.433)劃線接種到試管斜面促芽孢生長錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)7 d，用無菌去離子水洗滌離心(4 ℃、9 000 r/min、15 min)芽孢3次，芽孢懸浮液濃度大約調(diào)整到1.5×109 CFU/mL，4 ℃下保存[18]。實驗前將枯草桿菌芽孢懸浮液濃度調(diào)整到1.5×107 CFU/mL左右。

1.3.2 枯草桿菌芽孢懸浮液的HPTS結(jié)合酸處理

通過鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液將芽孢懸浮液pH值調(diào)整為1、4、7，各取10 mL芽孢懸浮液于無菌聚乙烯塑料袋中，抽真空封口后置于超高壓設(shè)備腔體中，處理介質(zhì)為水，作為壓力和溫度的傳遞介質(zhì)對芽孢懸浮液加壓升溫。壓力為550 MPa，處理溫度為 25、65、75 ℃，保壓處理20 min，處理時間不包括升壓和卸壓所需時間。壓力水平，時間和溫度由計算機控制。

1.3.3 枯草桿菌芽孢平板計數(shù)方法

將處理前后的芽孢懸浮液進行梯度稀釋后，在平板中吸取1 mL稀釋液并倒入15～20 mL TSA-YE培養(yǎng)基混勻，凝固后在 37 ℃下倒置培養(yǎng)24～48 h，計算菌落總數(shù)對數(shù)值。

1.3.4 枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量的測定

將處理前后的芽孢懸浮液離心(4 ℃、9 000 r/min)15 min，收集上清液，以無菌去離子水為空白參比，使用紫外分光光度計測定260 nm(核酸)和280 nm(蛋白質(zhì))處的吸光值。

1.3.5 流式細胞儀檢測枯草芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜通透性

取處理前后的芽孢懸浮液，將菌液濃度稀釋到106～107 CFU/mL。使用PI染色，在1 mL芽孢懸浮液中加入0.75 μL 20 mmol/L的PI染色液，在室溫下暗處孵育15 min。用流式細胞儀檢測前向散射光、側(cè)向散射光、熒光通道FL2和FL3。采用488 nm激發(fā)光，PI標(biāo)記細胞在615 nm處發(fā)紅色熒光(FL3)[19]。數(shù)據(jù)采集后用FSC Express Version 3.0軟件分析。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將處理前后的樣品進行冷凍干燥，于瑪瑙研缽中磨粉，再與干燥的KBr粉末混合均勻，壓片后置于傅里葉紅外變換光譜儀上，于4 000～500 cm-1內(nèi)進行掃描，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1。

1.3.7 統(tǒng)計分析

所有實驗至少重復(fù)3次。采用Origin 2018軟件對實驗結(jié)果進行分析和作圖，以P<0.05為顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢殺滅效果的影響

圖1為HPTS結(jié)合不同pH處理后枯草桿菌芽孢存活濃度的變化。由圖1可知，枯草桿菌芽孢處理前的初始計數(shù)約為1×107 CFU/mL。常溫常壓下pH=1、pH=4和pH=7單獨處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度分別為6.71、6.77、6.82 lgCFU/mL，與常溫常壓下pH值單獨處理相比，當(dāng)pH=1時，550 MPa結(jié)合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為5.62、2.53、0.57 lgCFU/mL；pH=4時，550 MPa結(jié)合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為6.46、3.6、2.52 lgCFU/mL；pH=7時，550 MPa結(jié)合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為6.69、3.97、2.59 lgCFU/mL。結(jié)果表明在常溫常壓下pH單獨處理均無法造成芽孢失活。當(dāng)pH=7時，550 MPa結(jié)合25 ℃處理對芽孢基本沒有殺滅效果，而pH=1和pH=4時，550 MPa結(jié)合 25 ℃ 處理對芽孢有一定的殺滅作用。當(dāng)pH=4和pH=7時，550 MPa結(jié)合75 ℃處理后芽孢的殺滅效果沒有顯著變化，而pH=1時，550 MPa結(jié)合75 ℃處理后芽孢存活濃度達到最低，殺滅效果顯著增強，芽孢最多被殺滅了6.25 lgCFU/mL，這可能是因為超高壓結(jié)合低pH促使芽孢變成脫離子H-芽孢。壓力和熱會增加芽孢對質(zhì)子的通透性，使得在低pH時芽孢核心部分發(fā)生再水化，說明酸性環(huán)境有利于HPTS殺滅枯草桿菌芽孢[15]。

2.2 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量(OD260和OD280)的影響

260 nm和280 nm 紫外吸收物質(zhì)的泄漏量常被用來檢測細胞膜通透性的變化。圖2為HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量(OD260、OD280)的影響。常溫常壓下，芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量隨著pH值降低有所增加。經(jīng)HPTS結(jié)合不同pH處理后，芽孢紫外吸收泄漏量增大，說明HPTS結(jié)合不同pH對芽孢的滲透屏障都造成了一定程度的損傷。隨著pH值的降低，550 MPa結(jié)合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量顯著增加，表明溫度升高到一定程度，酸會進一步破壞芽孢的滲透屏障，使得更多的核酸及蛋白質(zhì)類紫外吸收物質(zhì)泄漏出來。

圖1 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢存活濃度的影響
Fig.1 Effect of HPTS combined with different pH treatments on Bacillus subtilis spore survival concentration
注：圖中不同小寫字母表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05)

圖2 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收 物質(zhì)泄漏量的影響
Fig.2 Effect of HPTS combined with different pH treatments on the leakage of UV absorbing substances from Bacillus subtilis spores
注：不同大寫字母表示OD260值組內(nèi)差異顯著；不同小寫字母 表示OD280值組內(nèi)差異顯著

2.3 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢細胞膜損傷的流式細胞儀檢測

流式細胞儀經(jīng)常被用來檢測細菌細胞膜的損傷。圖3分別為HPTS結(jié)合不同pH處理芽孢后的流式細胞圖，反映芽孢內(nèi)膜通透性的改變[20]。使用熒光染料PI染色后，在嵌入雙鏈DNA時會發(fā)出紅色熒光。常溫常壓下，隨著pH值降低，芽孢內(nèi)膜的熒光分布沒有向M2移動，芽孢內(nèi)膜通透性沒有增大，與常溫常壓下pH值單獨處理相比，當(dāng)pH=1和pH=4時，550 MPa結(jié)合25 ℃處理后熒光分布基本沒有向M2移動，芽孢損傷程度較小，芽孢內(nèi)膜通透性變化較小，而pH=7時，550 MPa 結(jié)合25 ℃處理熒光分布明顯向M2移動，芽孢內(nèi)膜通透性增大。隨著溫度上升，HPTS結(jié)合不同pH，熒光分布明顯向M2移動，說明芽孢內(nèi)膜通透性增大，這與紫外吸收泄漏量的結(jié)果相一致。與HPTS單獨作用相比，HPTS結(jié)合pH=4和pH=7處理后M2比例基本相差不大，而HPTS結(jié)合pH=1處理后M2的比例明顯增大，說明HPTS結(jié)合pH=1與相同條件下HPTS單獨處理對芽孢內(nèi)膜的破壞作用更強，即可以認為HPTS結(jié)合pH=1增強了對芽孢內(nèi)膜的破壞，提高了對芽孢的殺滅效果。

2.4 HPTS結(jié)合酸處理前后枯草桿菌芽孢的傅里葉紅外光譜分析

圖4為枯草桿菌芽孢在HPTS結(jié)合酸處理前后的傅里葉紅外光譜圖，紅外檢測的波長范圍為4 000～500 cm-1，本實驗選取了芽孢殺滅效果最好和內(nèi)膜通透性破壞最嚴(yán)重的條件即pH=1，550 MPa結(jié)合75 ℃ 進行分析，研究HPTS在酸性條件下芽孢內(nèi)膜相態(tài)及化學(xué)組分結(jié)構(gòu)的變化。HPTS結(jié)合酸處理前后的紅外光譜圖的峰形、峰高變化細微，從而反映出芽孢處理前后的化學(xué)組分基本一致。為了進一步探究芽孢紅外光譜中特征波段的變化情況，需要對原紅外光譜圖進行數(shù)據(jù)分析處理。

二階導(dǎo)數(shù)處理是紅外譜圖分析中常用的方法[17]，它可以將原紅外譜圖中細微的差別分辨出來，有利于深入分析原紅外譜圖。圖5-a反映了芽孢內(nèi)膜脂肪酸相變化情況。波數(shù)大約在2 872、2 960 cm-1的譜帶分別表示CH3基團對稱和反對稱伸縮振動；波數(shù)約為2 852、2 919 cm-1的譜帶分別表示CH2基團對稱和反對稱伸縮振動[21]，與未處理和HPTS處理的枯草桿菌芽孢相比，HPTS結(jié)合酸處理后，原2 960、2 919 cm-1處的紅外吸收峰發(fā)生了移動，紅外吸收峰強度變化更加劇烈。以上紅外吸收峰反映了芽孢內(nèi)膜的相變化。圖5-a表明，芽孢內(nèi)膜磷脂的不流動性是由于其磷脂處于凝膠態(tài)[22]，經(jīng)過HPTS結(jié)合酸處理后，芽孢內(nèi)膜的磷脂分子疏水尾鏈混亂度增大，磷脂由凝膠態(tài)變?yōu)橐壕B(tài)，從而流動性增加，最終導(dǎo)致芽孢內(nèi)膜水分子通透屏障的受損。

a-pH=1、25 ℃處理；b-pH=4、25 ℃處理；c-pH=7、25 ℃處理；d-pH=1、550 MPa、25 ℃處理；e-pH=4、550 MPa、25 ℃處理； f-pH=7、550 MPa、25 ℃處理；g-pH=1、550 MPa、65 ℃處理；h-pH=4、550 MPa、65 ℃處理；i-pH=7、550 MPa、65 ℃處理； j-pH=1、550 MPa、75 ℃處理；k-pH=4、550 MPa、75 ℃處理；l-pH=7、550 MPa、75 ℃處理
圖3 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜通透性的影響
Fig.3 Effects of HPTS combined with different pH treatments on the membrane permeability of Bacillus subtilis spores
注：M1代表熒光強度較低的陰性區(qū)域；M2代表熒光強度較高的陽性區(qū)域

圖4 HPTS結(jié)合酸處理前后枯草桿菌芽孢的紅外光譜圖
Fig.4 FT-IR spectra of Bacillus subtilis spores before and after HPTS combined with acid treatment

圖5-b反映了芽孢蛋白酰胺Ⅰ帶的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化。從圖5-b中可以看出，HPTS結(jié)合酸處理后，1 674 cm-1處的紅外吸收峰發(fā)生了明顯的變化，從未處理的1 674 cm-1處移動到1 676 cm-1處；1 652 cm-1的紅外吸收峰移動到了1 650 cm-1；1 644 cm-1的紅外吸收峰移動到了1 646 cm-1處，其中1 674 cm-1的吸收峰代表蛋白質(zhì)β折疊結(jié)構(gòu)，1 652、1 644 cm-1代表蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)[23]。由此表明，經(jīng)過HPTS結(jié)合酸處理后，紅外吸收峰的位置和峰形均發(fā)生了明顯的變化，芽孢蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生了變性。原因可能是酸改變了芽孢內(nèi)膜的電荷，影響其正常生理功能，同時，酸性條件改變了氨基酸分子側(cè)鏈的電離狀態(tài)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變[15]，在高壓和溫度作用下，芽孢蛋白質(zhì)更容易發(fā)生變性。

圖5-c反映了芽孢核酸骨架振動變化。波數(shù)大約在1 080、1 220 cm-1的譜帶分別表示PO基團對稱與反對稱伸縮振動[17]，與未處理和HPTS處理的芽孢相比，HPTS結(jié)合酸處理后，以上2處紅外吸收峰位置向低波數(shù)遷移，吸收峰強度減弱。這是因為HPTS結(jié)合酸處理后，進一步加劇了芽孢內(nèi)核酸物質(zhì)的變性，核酸分子內(nèi)的氫鍵減弱使得峰位向低波數(shù)遷移。此外，1 200～900 cm-1波段主要表示C—O—C伸縮振動，可以反映處理前后細胞壁肽聚糖層結(jié)構(gòu)的變化[24]。從圖5-c中可以發(fā)現(xiàn)，芽孢在HPTS處理后肽聚糖層和細胞壁已經(jīng)明顯改變，結(jié)合酸處理后的變化更加強烈(1 015 cm-1)。芽孢皮層肽聚糖支架是其耐壓特性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在萌發(fā)后形成細胞壁[25]。芽孢皮層肽聚糖和細胞壁結(jié)構(gòu)的改變可能使芽孢皮層破裂，從而導(dǎo)致芽孢死亡。

a-3 000～2 800 cm-1波段；b-1 700～1 600 cm-1波段；c-1 300～900 cm-1波段
圖5 HPTS結(jié)合酸處理前后枯草桿菌芽孢的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖
Fig.5 Second-derivative infrared spectra of Bacillus subtilis spores before and after HPTS combined with acid treatment

3 結(jié)論

(1)將芽孢懸浮液的pH值調(diào)整為1、4、7，于550 MPa 結(jié)合25、65、75 ℃處理20 min，平板計數(shù)結(jié)果表明，常溫常壓下pH值單獨處理均無法造成芽孢失活。當(dāng)HPTS結(jié)合不同pH處理后，隨著pH值降低，芽孢的殺滅效果明顯增強，當(dāng)pH=1時，550 MPa結(jié)合75 ℃ 條件下芽孢最多被殺滅了6.25 lgCFU/mL。

(2)對芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量和內(nèi)膜通透性研究發(fā)現(xiàn)，常溫常壓下，芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量隨著pH值降低有所增加；相比HPTS單獨作用，HPTS結(jié)合不同pH處理后，芽孢紫外吸收泄漏量大幅增加，pH值越低，芽孢紫外吸收泄漏量越大。常溫常壓下，隨著pH值降低，芽孢內(nèi)膜通透性沒有增大；隨著溫度上升，HPTS結(jié)合不同pH處理后芽孢內(nèi)膜通透性增大；HPTS結(jié)合pH=4和pH=7處理后，陽性區(qū)域比例基本相差不大，而HPTS結(jié)合pH=1處理后陽性區(qū)域的比例明顯增大，表明芽孢內(nèi)膜通透性顯著增加，芽孢內(nèi)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，這與芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量的結(jié)果相一致。

(3)對不同處理后的芽孢的傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，相比對照組和HPTS單獨作用，HPTS結(jié)合酸處理后，芽孢內(nèi)膜磷脂相態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，磷脂由凝膠態(tài)變?yōu)橐壕B(tài)，膜脂流動性增加；芽孢蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性；芽孢內(nèi)核酸物質(zhì)變性，皮層肽聚糖和細胞壁結(jié)構(gòu)改變。

綜上所述，芽孢內(nèi)膜的極端不通透性和膜脂的不流動性是芽孢難以被殺滅的重要原因，本實驗圍繞芽孢內(nèi)膜進行研究，發(fā)現(xiàn)單獨pH處理無法對芽孢內(nèi)膜造成損傷，而在HPTS單獨作用的基礎(chǔ)上，HPTS結(jié)合酸使芽孢內(nèi)膜通透性顯著增加，膜脂的流動性增加，推測是因為HPTS促使芽孢快速萌發(fā)，并對內(nèi)膜造成損傷后，低pH進一步破壞芽孢內(nèi)膜的水分子通透屏障，使得水分子更容易透過芽孢內(nèi)膜進入芽孢內(nèi)核，芽孢內(nèi)核含水量不斷增加，芽孢自身的極端抗性就會大大降低，進而可以有效殺滅芽孢，這對于研究芽孢殺菌抗性及HPTS在殺滅細菌芽孢上的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。