一株高產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌的分離及產(chǎn)香特性研究

高溫堆積發(fā)酵是白酒生產(chǎn)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，又稱“二次制曲”，堆積發(fā)酵可匯聚空氣中的微生物[1-2]，促進(jìn)酒醅中的淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行分解轉(zhuǎn)化，還為美拉德反應(yīng)提供反應(yīng)條件及前體物質(zhì)[3]。高溫堆積發(fā)酵可以較好地改良原酒酒體的風(fēng)味與品質(zhì)，改善原酒的風(fēng)格及豐富原酒的香味物質(zhì)成分，為形成酒體風(fēng)格提供香味成分或積累香味前體物質(zhì)[4]發(fā)揮重要的作用。

張治剛等[5]利用GC法對(duì)賈湖白酒的香氣成分進(jìn)行分析檢測(cè)，得出醇類物質(zhì)是香氣成分中占比最大一類物質(zhì),大量文獻(xiàn)表明，白酒中主要醇類物質(zhì)除乙醇外，還有丙醇、正丁醇、異丁醇等高級(jí)醇，且含有芳香族類的β-苯乙醇[6-9]。β-苯乙醇是白酒、黃酒、醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要的風(fēng)味物質(zhì)，具有柔和、淡雅細(xì)膩的玫瑰氣味[10]。β-苯乙醇是白酒形成獨(dú)特風(fēng)味的重要因素之一，同時(shí)也與擁有玫瑰香氣的壬酸乙酯的合成有關(guān)[6]。由此可見(jiàn)，β-苯乙醇對(duì)白酒呈香具有較為重要的影響[5,11]。酵母菌是合成β-苯乙醇主要菌屬，已有釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母等種屬合成β-苯乙醇的研究[12-15]。因此本文嘗試從賈湖酒廠高溫堆積酒醅中分離篩選出高產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定、產(chǎn)香培養(yǎng)條件優(yōu)化以及產(chǎn)香特性的研究[16-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

賈湖高溫堆積酒醅樣品；β-苯乙醇標(biāo)品、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)、UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、2×San Taq PCR Mix，上海生工生物工程有限公司；色譜級(jí)甲醇，Giovini Chemical Technology有限公司；磷酸二氫鉀，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水葡萄糖、無(wú)水硫酸鎂，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

YP20001電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；D-37085 PCR儀，Veriti(德國(guó))；UV-1800PC分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；Tanon-3500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；GR85DA型蒸汽滅菌鍋，濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；SHP-25型恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZNC-1500智能型潔凈工作臺(tái)，蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)[18]。其中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分調(diào)整為(g/L):酵母提取物10.0、L-Phe 5.0、蛋白胨10.0、磷酸二氫鉀2.0、無(wú)水硫酸鎂0.5、葡萄糖25.0。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酵母菌株的分離和產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株篩選

無(wú)菌條件下，取適量高溫堆積酒醅加入到含100 mL 無(wú)菌水錐形瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)30 min。取不同稀釋梯度涂布于PDA培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)2 d，觀察菌株形態(tài)。將分離菌株30 ℃、200 r/min培養(yǎng)15 h，以1%接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至葡萄糖完全耗盡結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min，取上清液，高效液相色譜法檢測(cè)β-苯乙醇含量。

1.4.2 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：選取培養(yǎng)24 h菌株純培養(yǎng)物，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞觀察和菌落形態(tài)觀察。

分子生物學(xué)鑒定：使用試劑盒提取酵母菌基因組，以基因組DNA為模板進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，所用引物為通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系、基因測(cè)序及序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法均參考文獻(xiàn)[18]。

1.4.3 菌株對(duì)苯乙醇、乙醇和NaCl耐受性的檢測(cè)

采用平板劃線法考察菌株耐受性。β-苯乙醇添加質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L；乙醇添加體積分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%；NaCl添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%。

1.4.4 菌株的最適生長(zhǎng)初始pH值和溫度

將菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至pH值為1～10的100 mL YPD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，每隔12 h測(cè)量吸光值OD600。溫度設(shè)置為20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)48 h，同樣每隔12 h測(cè)量吸光值OD600。

1.4.5 β-苯乙醇合成優(yōu)化試驗(yàn)

依次考察碳源種類(麥芽糖、葡萄糖、蔗糖)及質(zhì)量濃度(20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 g/L)、氮源種類(酵母提取物、蛋白胨)及質(zhì)量濃度(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L)、L-Phe(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L)對(duì)菌株發(fā)酵合成β-苯乙醇的影響。

1.4.6 菌株的產(chǎn)香試驗(yàn)

將菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基活化15 h，按1%的接種量接種50 mL優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液離心，取上清液[18]，采用同時(shí)蒸餾萃取法萃取香氣成分，GC-MS法檢測(cè)發(fā)酵液揮發(fā)性成分。

1.4.7 高效液相色譜法測(cè)定β-苯乙醇含量

采用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾發(fā)酵上清液，HPLC測(cè)定β-苯乙醇含量。操作參數(shù)：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=1∶1；流速0.3～0.5 mL/min梯度上升；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL[5,18]。

1.4.8 同時(shí)蒸餾萃取法和GC-MS分析條件

發(fā)酵液離心，取5 mL上清液利用同時(shí)蒸餾萃取裝置濃縮至1.0 mL，有機(jī)濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入1.5 mL色譜瓶，待GC-MS上樣。GC-MS條件參數(shù)：毛細(xì)管色譜柱DB-FFAP(60 m×250 μm×0.25 μm)；手動(dòng)進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫50 ℃，保留2 min，以8 ℃/min 的速率升至120 ℃，保留2 min；再以10 ℃/min升至200 ℃，穩(wěn)定5 min；最后以5 ℃/min升至250 ℃，穩(wěn)定20 min；檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣為He，流速1 mL/min；電子轟擊電離(electron impact ionization，EI)源，電子能量70 eV；掃描范圍10～500 u；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-苯乙醇合成酵母篩選

通過(guò)梯度稀釋結(jié)合平板涂布法[18]從酒醅中分離出8株菌株，經(jīng)菌落形態(tài)和顯微觀察，8株酵母都具有典型的酵母菌特征，初步判定這些菌株為酵母菌，分別編號(hào)為Z01，Z02，Z03，Z04，Z05，Z06，Z07和Z08。將轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，考察其轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果如圖1所示。其中，酵母菌株Z08合成β-苯乙醇能力最強(qiáng)，含量達(dá)到(2.01±0.043)g/L，因此后續(xù)選用酵母Z08進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖1 不同酵母菌株發(fā)酵液中β-苯乙醇含量
Fig.1 β-phenylethanol concentration in fermentation broth of different yeast strains

2.2 酵母Z08的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株Z08其平板菌落和細(xì)胞形態(tài)特征見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，菌落呈現(xiàn)乳黃色，表面光滑，黏稠，邊緣整齊(圖2-a)；菌體為長(zhǎng)橢圓形，無(wú)菌絲體，具有酵母菌株特征(圖2-b)。

a-菌株Z08菌落形態(tài)特征；b-菌株Z08細(xì)胞形態(tài)特征
圖2 菌株Z08在YPD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征及光學(xué) 顯微鏡(10×100倍)下細(xì)胞形態(tài)特征
Fig.2 Strain Z08 colony morphology characteristics on YPD medium and cell morphology characteristics under optical microscope (10×100 times)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)PCR成功擴(kuò)增出酵母Z08的ITS1～I(xiàn)TS4片段，測(cè)序后獲得基因序列，將其于Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明該菌與庫(kù)德里阿茲威(氏)畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)的同源性最高，其相似度達(dá)到90%。使用MEGA X構(gòu)建菌株間系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果表明酵母Z08與庫(kù)德里阿茲威(氏)畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)的親緣關(guān)系最近。根據(jù)分子生物學(xué)鑒定菌株Z08屬于庫(kù)德里阿茲威(氏)畢赤酵母。

圖3 基于ITS基因序列的Z08菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 Phylogenetic tree of Z08 strain based on ITS gene sequence

2.3 菌株耐受性測(cè)定

按照方法1.4.3分別考察菌株Z08對(duì)β-苯乙醇、乙醇、NaCl的耐受特性，結(jié)果如表1所示，當(dāng)β-苯乙醇質(zhì)量濃度為4.0 g/L時(shí)，該菌生長(zhǎng)受到抑制；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到6.0 g/L時(shí)，菌株完全不能生長(zhǎng)。該菌對(duì)乙醇最大耐受體積分?jǐn)?shù)為10%，屬于乙醇高耐受性菌株；而其對(duì)NaCl的最大耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)5%，也具有一定的耐高滲能力。

表1 酵母菌株Z08耐受性試驗(yàn)結(jié)果
Table 1 Yeast strain Z08 tolerance test results

注：“+”表示菌株生長(zhǎng)；“-”表示菌株不生長(zhǎng)

2.4 最適生長(zhǎng)pH值和溫度

按照方法1.4.4分別考察菌株的最適生長(zhǎng)pH和最適生長(zhǎng)溫度。如圖4-a所示，酵母Z08在pH 1～10均能生長(zhǎng)，pH適應(yīng)范圍廣，具有一定酸堿耐受能力。該菌最適生長(zhǎng)pH為6～8，比一般酵母最適生長(zhǎng)pH 4.0～5.5高。從圖4-b可以看出，酵母Z08最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，與大多數(shù)酵母生長(zhǎng)最適生長(zhǎng)溫度相一致。

a-酵母菌株Z08的最適生長(zhǎng)pH；b-酵母菌株Z08的最適生長(zhǎng)溫度
圖4 酵母菌株Z08的最適生長(zhǎng)pH和溫度
Fig.4 Optimal growth pH and temperature of yeast strain Z08

2.5 酵母Z08優(yōu)化合成β-苯乙醇

2.5.1 碳源種類對(duì)生物轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的影響

按照方法1.4.5考察碳源對(duì)β-苯乙醇合成的影響。根據(jù)酵母菌同化碳源試驗(yàn)文獻(xiàn)，選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源，質(zhì)量濃度均為50.0 g/L，L-Phe添加量為6.0 g/L，其余成分均與轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基相同，發(fā)酵結(jié)果如表2所示，Z08基本無(wú)法利用蔗糖和麥芽糖生產(chǎn)β-苯乙醇，但可以利用葡萄糖高效合成β-苯乙醇。

表2 不同碳源對(duì)轉(zhuǎn)化合成β-苯乙醇的影響
Table 2 The influence of different carbon sources on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 g/L的葡萄糖，考察不同葡萄糖濃度對(duì)β-苯乙醇合成水平的影響，結(jié)果如圖5所示。葡萄糖質(zhì)量濃度為20.0～60.0 g/L時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，β-苯乙醇產(chǎn)量也在增加。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)β-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高值(2.78±0.049)g/L，而當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度增加到80.0、100.0 g/L時(shí)，β-苯乙醇產(chǎn)量大幅下降。

圖5 不同濃度葡萄糖對(duì)轉(zhuǎn)化合成β-苯乙醇的影響
Fig.5 The effect of different concentrations of glucose on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

2.5.2 氮源對(duì)生物轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的影響

按照方法1.4.5考察碳源對(duì)β-苯乙醇合成的影響。根據(jù)酵母菌文獻(xiàn)報(bào)道，選擇酵母提取物和蛋白胨，質(zhì)量濃度為10 g/L，在培養(yǎng)基中添加6.0 g/L L-Phe，發(fā)酵結(jié)果如表3所示，酵母提取物作為氮源時(shí)，β-苯乙醇產(chǎn)量比蛋白胨高1.53倍。

表3 不同氮源對(duì)轉(zhuǎn)化合成β-苯乙醇的影響
Table 3 Effects of different nitrogen sources on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L酵母提取物，考察不同酵母提取物濃度對(duì)β-苯乙醇合成水平的影響，結(jié)果如圖6所示。酵母提取物在0～7.0 g/L時(shí)，β-苯乙醇產(chǎn)量增加較明顯，當(dāng)酵母提取物質(zhì)量濃度超過(guò)7.0 g/L后，β-苯乙醇產(chǎn)量雖然在增加，但幅度不大。

圖6 酵母提取物濃度對(duì)β-苯乙醇轉(zhuǎn)化合成的影響
Fig.6 Effect of yeast extract concentration on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

2.5.3 L-Phe對(duì)生物轉(zhuǎn)化β-苯乙醇的影響

酵母合成β-苯乙醇主要是通過(guò)艾氏途徑，消耗底物L-Phe，將其轉(zhuǎn)化為β-苯乙醇。按照方法1.4.5考察不同L-Phe濃度對(duì)β-苯乙醇合成的影響，結(jié)果如圖7所示。在L-Phe質(zhì)量濃度為0～4.0 g/L時(shí)，隨著底物的增加，β-苯乙醇合成水平不斷增加，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)4.0 g/L后，β-苯乙醇合成水平開始下降。

圖7 不同濃度L-Phe對(duì)轉(zhuǎn)化合成β-苯乙醇的影響
Fig.7 The effect of different concentrations of L-Phe on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

2.5.4 培養(yǎng)基主要成分的正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素優(yōu)化試驗(yàn)初步確定酵母菌Z08合成β-苯乙醇主要影響因子為酵母抽提物、葡萄糖、L-Phe和pH，磷酸二氫鉀和無(wú)水硫酸鎂由于單因素試驗(yàn)不能綜合反應(yīng)各因素、水平間的交互作用，因此在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，即2.0 g/L的磷酸二氫鉀和0.5 g/L的無(wú)水硫酸鎂的條件下，采用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分為葡萄糖50.0 g/L，酵母提取物12.0 g/L，L-Phe 5.0 g/L，pH 6.0，可見(jiàn)酵母提取物對(duì)酵母細(xì)胞Z08合成β-苯乙醇有顯著影響。

2.5.5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-苯乙醇產(chǎn)量的影響

由于β-苯乙醇具有一定的揮發(fā)性，因此合適的發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-苯乙醇合成也有一定影響。在上文確定最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間β-苯乙醇含量，結(jié)果如圖8所示。發(fā)酵38 h時(shí)達(dá)到最高產(chǎn)量(3.74±0.084)g/L，隨后產(chǎn)量逐漸下降，并且菌體密度不斷降低，因此確定38 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析
Table 4 Result analysis and design of orthogonal experiment

2.6 酵母Z08發(fā)酵產(chǎn)香特性

將菌株酵母Z08接種于優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液取10 mL，離心除去菌體，取上清液與二氯甲烷等體積混合后進(jìn)行蒸餾收集餾分。采用GC-MS對(duì)餾分進(jìn)行揮發(fā)性香味成分進(jìn)行分析，各成分含量檢測(cè)結(jié)果如表5所示，在發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分中，醇類化合物相對(duì)含量最高，達(dá)到了55.38%，其中苯乙醇相對(duì)含量達(dá)到了55.32%。其次是芳香族化合物，相對(duì)含量為16.17%，以2,4-二甲基苯并[H]喹啉為主，其相對(duì)含量為4.42%。酯類化合物相對(duì)含量為14.35%，以乙酸苯乙酯為主，其相對(duì)含量為8.91%。酮類化合物相對(duì)含量為10.71%，其中以2-乙基吖啶為主，相對(duì)含量為5.47%。酸類物質(zhì)相對(duì)含量為0.78%，醛類物質(zhì)相對(duì)含量為0.16%，還有一些其他的烷烴類和雜環(huán)類和未測(cè)定出的化合物，總相對(duì)含量為2.45%。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-苯乙醇產(chǎn)量的影響
Fig.8 The effect of different conversion times on the yield of β-phenylethanol

表5 酵母Z08發(fā)酵液中揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果
Table 5 Test results of volatile components in yeast Z08 fermentation broth

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外發(fā)酵生產(chǎn)β-苯乙醇菌種以酵母菌為主，如產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和克魯維酵母(Kluyveromyces sinensis)等[20]。本文針對(duì)賈湖堆積酒醅中的酵母進(jìn)行分離、篩選，從中獲得1株產(chǎn)β-苯乙醇的酵母菌株。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)該酵母Z08為庫(kù)德里阿茲威(氏)畢赤酵母。庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichia kudriarzerii)存在于各種天然發(fā)酵、果實(shí)和土壤中，能夠較好地適應(yīng)各種環(huán)境壓力，如低氧、低pH值、高溫、高乙醇濃度等等。在傳統(tǒng)食品和飲料的發(fā)酵過(guò)程中容易分離得到，如白酒、可可豆發(fā)酵、葡萄酒、發(fā)酵乳等。通過(guò)考察Z08對(duì)β-苯乙醇、乙醇、NaCl的耐受性，發(fā)現(xiàn)其具有較好的乙醇和耐高滲特性。同時(shí)驗(yàn)證了該菌在不同溫度和pH條件下生長(zhǎng)情況，確定該菌株具有較寬泛pH生長(zhǎng)范圍。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)最終確定了該菌株最適發(fā)酵條件為葡萄糖50 g/L、酵母提取物12.0 g/L、L-Phe 5.0 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L和無(wú)水硫酸鎂0.5 g/L。在溫度30 ℃，pH 6.0，200 r/min條件下發(fā)酵38 h后，β-苯乙醇產(chǎn)量最終達(dá)到(3.74±0.084)g/L，比優(yōu)化前大幅提升。產(chǎn)香試驗(yàn)結(jié)果表明，苯乙醇、芳香族化合物、乙酸苯乙酯等香味物質(zhì)含量較高。在產(chǎn)香成分中，苯乙醇、乙酸苯乙酯、2-苯乙基-環(huán)己烷-1,3-二酮等多種風(fēng)味物質(zhì)對(duì)白酒品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)，說(shuō)明該菌株產(chǎn)香特性有利于其在白酒釀造中的進(jìn)一步應(yīng)用，對(duì)提升白酒品質(zhì)有重要意義。此外，庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichia kudriarzerii)還具有作為益生菌和生物控制劑的潛力，同時(shí)該菌也在生物乙醇、甘油和琥珀酸生產(chǎn)等方面發(fā)揮重要作用[21]。