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丙型肝炎病毒核心蛋白對膽管癌細胞NFAT1基因表達的影響

作者:廖巧芳1李志花1陳汝福2郭寧2曾兵2程帝1鄭禮平來源:《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》日期:2012-07-07人氣:981

丙型肝炎病毒核心蛋白對膽管癌細胞NFAT1基因表達的影響

廖巧芳1  李志花1   陳汝福2   郭寧2   曾兵2   程帝1  鄭禮平1

(1.腫瘤科2.肝膽外科,中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院 廣東廣州 510120)

(1.Department of Oncology,2.Department of Hepatobiliary Surgery,Sun Yat-Sen Memorial Hospital,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510120, China)

摘要:目的 探討丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)是否通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄及炎癥因子NFAT1的表達參與肝內(nèi)膽管癌的發(fā)展及惡性生物學(xué)行為。方法 構(gòu)建表達HCV C核心蛋白的真核表達質(zhì)粒pEGFP-N3-HCV C,通過瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-HCV C質(zhì)粒,qRT-PCR檢測肝內(nèi)膽管癌RBE細胞中NFAT1 mRNA的表達,Western blot檢測NFAT1蛋白的表達,MTT法檢測細胞增殖,流式細胞儀檢測細胞周期。結(jié)果 轉(zhuǎn)染HCV C后膽管癌細胞NFAT1基因的mRNA及蛋白表達明顯上升,差異具有顯著性(P<0.05);HCV C能夠促進細胞向G2/M期進展及促進細胞增殖。結(jié)論 HCV C上調(diào)膽管癌細胞中NFAT1基因的表達,促進細胞周期進展及膽管癌細胞增殖,可能與肝內(nèi)膽管癌的發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞:人膽管癌細胞RBE,HCV C ,NFAT,細胞周期,細胞增殖

The effect of hepatitis C virus core gene transfection on expression of nuclear factor of activated T cells one in human   biliary carcinoma cell lines

Abstract:Objective To explore the effect of hepatitis C virus core protein (HCV C) on the regulation and inflammation of the NFAT1 transcription factor expression in the intrahepatic bile duct carcinoma .Methods The recombinant plasmid(pEGFP-N3-HCV C) and the vector alone were cotransfected with enhanced green fluorescent protein( EGFP) into RBE cells using liposome. The real time RT-PCR and Western blot were used to show the expression of NFAT1 mRNA and protein.Results After HCV C transfection, the expressions of NFAT1 mRNA and protein in RBE Cell were enhanced(P<0.05).Conclusion HCV C gene transfection upregulates the transcriptional expression of NFAT1 mRNA in biliary carcinoma cells, it is suggested that HCV C protein contributes to virus carcinogenesis.

Key words: human  biliary carcinoma cell lines RBE, Hepatitis C virus core protein, nuclear factor of activated T cells NFAT,cell cycle ,cell proliferation

 

    丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)通過與細胞蛋白的結(jié)合,對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達調(diào)控及宿主的免疫等多個方面起到調(diào)節(jié)作用。在這過程中,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、Sp-1、STAT3等通過不同的途徑被激活[1]。近年來,轉(zhuǎn)錄及炎癥因子NFAT家族在腫瘤細胞中的作用受到越來越多的重視,已有研究證實NFAT亞型在乳腺癌[2]、結(jié)腸癌[3]、胰腺癌[4], [5]中的表達增高,而且在腫瘤的侵襲、分化、存活甚至血管形成及腫瘤微環(huán)境中都起著一定的作用。為了探討HCV C可能的致癌機制,本實驗通過探討HCV C是否上調(diào)膽管癌RBE細胞中NFAT1基因的表達來初步探討HCV C的可能致瘤機制。

1    材料與方法

1.1 材 料

人膽管癌細胞株RBE細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫,RPMI1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自GIBCO公司;NFAT1鼠抗人單克隆抗體購自Abcam公司;RNA提取試劑Trizol、脂質(zhì)體(lipofectamineTM 2000)均購自美國Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。pEGFP-N3載體購自萊德爾公司,無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自廣州津美公司;96孔板購自美國corning公司;4-甲偶氮唑藍( MTT ) 購自碧云天生物技術(shù)研究所;二甲基亞砜購自美國Sigma公司。

1.2  細胞培養(yǎng)

RBE細胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37℃、體積分數(shù)5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1~2 d 換液,當(dāng)細胞生長接近90%融合時,用質(zhì)量濃度0.25%胰酶消化細胞,以1:2或1:3比例傳代。

1.3  pEGFP-N3-HCV C真核表達質(zhì)粒構(gòu)建

  將pEGFP-N3載體和HCVc PCR片段分別用Hind Ⅲ和XhoⅠ雙酶切后,凝膠回收純化產(chǎn)物。將兩個片段用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜,取5μl轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落,接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩過夜。用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA,再鑒定外源基因的插入,送菌液于公司進行測序分析。

1.4瞬時轉(zhuǎn)染

將3~4 x 105個RBE細胞重懸于2ml含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中;37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,使細胞達90%~95%融合,實驗分組:A組為處理組,共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N3 和HCV C;B組僅轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,C組為空白組,僅以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。按Lipofectamine™2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書,進行細胞轉(zhuǎn)染,24~48 h后收集細胞進行轉(zhuǎn)染后檢測。每組實驗重復(fù)3次。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染熒光檢測及轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)學(xué)特點

    轉(zhuǎn)染48h后,倒置相差熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6流式細胞儀分析細胞周期

將濃度為3×105個/mL的RBE 細胞接種于6 孔板內(nèi),培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后,按說明書進行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染處理后24h,收集細胞,在PBS 中吹勻為單細胞懸液,750mL/L乙醇4℃固定過夜, 固定后細胞以PBS 洗滌2次。在避光條件下加入PI染液,室溫孵育30 min,用流式細胞儀分析樣品。

1.7 MTT法檢測HCVc對細胞增殖的影響

   取處于對數(shù)期生長的RBE細胞,接種細胞密度為1×106/mL,接種于96孔板,培養(yǎng)24小時,約70%-80%融合后,轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒,分為HCVc質(zhì)粒組,空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,空白對照組,置于培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中,培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后,移出培養(yǎng)液,換入無血清RPMI1640培養(yǎng)液200ul/孔,并每孔加入MTT(5mg/ml)10ul。繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄去原培養(yǎng)液,每孔中加入DMSO100ul,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解并于酶聯(lián)免疫檢測儀490nm 波長處檢測吸光度A值,以A值反映活細胞水平,實驗重復(fù)3次。

1.8 SYBR Green實時定量PCR 檢測基因NFAT1的mRNA表達

  1.8.1  pEGFP-N3-HCV C質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染RBE細胞24h后,Trizol法提取各組細胞的總RNA,用紫外分光光度計檢測提取RNA的濃度及純度,并確定RNA的純度在1.8~2.0之間。按RT試劑盒操作說明書合cDNA。由TaKaRa公司合成NAT1及β-actin引物,NFAT1(136 bp)上游引物:5′-ACCAGTACCCGCACTTGCAC-3′,下游引物:5′-CGCTTCTCGCTCTCGTTCAG-3′。β-actin (186 bp)上游引物:5′-

TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 30 s, 94℃ 15 s 及60℃ 30 s, 共40個循環(huán),95℃ 15 s,60℃ 15 s,95℃ 15 s。從60℃到95℃每上升0.5℃ 取一次熒光值,最后生成融解曲線,通過融解曲線確定反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。所有標本均重復(fù)檢測3次,計算出Ct 值,各基因mRNA 相對表達量采用2-△△Ct法進行計算分析,并用圖像定量分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.8.2 2-△△Ct法對NFAT1基因進行相對定量 

通過相對定量(relative quantity ,RQ)法(RQ =2-△△Ct)計算目的基因相對于參照因子(calibrator)的倍數(shù)來比較基因的表達差異。管家基因GAPDH 作為內(nèi)參基因,每一個樣本的△Ct= Ct(target gene)2 Ct (β-actin) ,而△△Ct=△Ct(target gene)-△Ct(calibrator)。

1.9  Western blot測定NFAT1蛋白的表達

pEGFP-N3-HCV C質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染RBE細胞48h后,按說明書提取總蛋白。調(diào)整樣品蛋白濃度使其相同,取樣品經(jīng)8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF)膜上。PVDF膜以50g/L脫脂奶粉封閉1~3h,加入NFAT1鼠抗人單克隆一抗(1∶500)于4℃孵育過夜。經(jīng)TBST漂洗3次后,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶5000),室溫孵育1h,TBST漂洗3次,ECL化學(xué)發(fā)光法試劑盒顯影、曝光。掃描圖像并保存,經(jīng)BioRad公司的圖形分析軟件Quantity One對圖片進行分析并測定灰度值。取NFAT1/GAPDH的灰度值之比作為蛋白的相對表達量。

2.0 統(tǒng)計學(xué)方法

每組實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(χ±s)表示,應(yīng)用統(tǒng)計軟件包SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,對數(shù)據(jù)采用兩獨立樣本的t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2    結(jié)  果

2.1 細胞轉(zhuǎn)染熒光檢測 

    細胞轉(zhuǎn)染48h后均可見較多特異性GFP綠色熒光的表達,表明我們的轉(zhuǎn)染相對成功。

2.2 pEGFP-N3-HCV C基因重組鑒定 將重組真核表達質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切以及重組質(zhì)粒DNA 序列送經(jīng)公司測定證實重組真核表達質(zhì)粒中包含目的片段HCV C,同時Western blot結(jié)果證實目的條帶約為45bp,證實含有目的基因HCV C的重組真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖三)。      

2.3  HCV C基因?qū)FAT1 mRNA水平表達的影響

     經(jīng)Real Time PCR分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染HCV C基因RBE組的NFAT1/β-actin 光密度比值是2.03 ± 0.32,空質(zhì)粒組為1.12±0.28,空白組為1.00 ± 0.11,與空白組比較,轉(zhuǎn)染HCV C基因組細胞NFAT1表達量顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4  HCV C基因?qū)FAT1蛋白水平表達的影響

     Western blot 結(jié)果顯示pEGFP-N3-HCVc質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)48 h后,空白組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的NFAT1/GAPDH灰度值比值分別是0.68±0.26、0.79 ± 0.02、1.75 ± 0.01,與空白組和空質(zhì)粒組比較,轉(zhuǎn)染HCV C組NFAT1蛋白表達量顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(見圖五)

2.5 HCV C對RBE細胞的細胞周期及細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染HCV C后,與空質(zhì)粒組細胞G0/G1期(74.34±0.6%)相比,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組細胞百分比降低,為(69.16±1.2%),同時發(fā)現(xiàn)S期及G2/M期細胞數(shù)相應(yīng)升高。同時通過圖7可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HCV C質(zhì)粒組、控制立足、空白組RBE細胞生長曲線比較,轉(zhuǎn)染HCV C基因組細胞生長速度明顯增快(P<0.05)

3  討  論

    HCV(hepatitis C virus)是導(dǎo)致丙型病毒性肝炎的病原體,亦是肝硬化(LC)和肝細胞癌(HCC)的主要病因[6]。前期研究證明丙型肝炎病毒的慢性持續(xù)感染與膽管癌發(fā)病密切相關(guān)[7],[8]。但它們之間的確切致病機制仍未完全闡明。HCV可被蛋白酶裂解成3~4個結(jié)構(gòu)蛋白和至少6個非結(jié)構(gòu)蛋白,其中核心蛋白是一個多功能蛋白,能夠影響多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活多種病毒及細胞啟動子,參與細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)化及免疫逃逸,從而在病毒的致病、致癌機制中發(fā)揮著重要的作用。如在穩(wěn)定表達HCV C蛋白的HepG2細胞系中,C蛋白上調(diào)c-Myc而促進細胞周期進程[9];HCV C蛋白還可通過與CDK活化激酶(CDK activating kinase,CAK)相互作用而抑制了E2F介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄、CDK4和CDK2的活性等環(huán)節(jié),從而抑制細胞從G1期到S期的進程,導(dǎo)致細胞周期進程發(fā)生阻滯[10]。

活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell, NFAT)是細胞內(nèi)多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)分子,可調(diào)節(jié)IL-2、IL- 3、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因和環(huán)氧化酶-2(COX-2)等多種細胞因子的表達水平, 影響生物體的基礎(chǔ)免疫和抗腫瘤免疫狀態(tài),促進腫瘤細胞生長和腫瘤血管的生成,是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要影響因素[11],[12]。NFAT蛋白家族分為5大類,包括NFAT1 (NFATc2或NFATp)、NFAT2(NFAT c1或NFATc)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATx或NFATc3) 和NFAT5(TonEBP或OREBP )[13]

在NFAT蛋白中,NFAT1~4亞型有NFAT同源區(qū)(NFAT-homology region, NHR)和Rel同源區(qū)(Rel-homology region, RHR)兩個非常保守的區(qū)域。NHR區(qū)域能與鈣調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶結(jié)合并由其激活。在靜止細胞中,NFAT蛋白被磷酸化存在于細胞漿中,對DNA具有低親和力。Ca2+/CaN是NFAT活化的最主要途徑,當(dāng)各種途徑引起的細胞內(nèi)游離Ca2 +濃度增高, CaN的活性隨之增強并與NFAT的NHR位點結(jié)合,引起NFAT脫磷酸、向細胞核內(nèi)易位以及與DNA的結(jié)合力增強, 進而調(diào)節(jié)多種細胞因子的轉(zhuǎn)錄表達水平[14]。Bcrgqvist等用Jurkat細胞來研究時發(fā)現(xiàn)核心蛋白促進了IL-2啟動子的轉(zhuǎn)錄激活,其活化程度依賴于NFAT的活化。通過后來更進一步的實驗發(fā)現(xiàn),核心蛋白是通過誘導(dǎo)Ca2+的振動來調(diào)節(jié)鈣信號的功效,從而促進NFAT的活化,進而使IL-2基因轉(zhuǎn)錄被激活[15]。

為明確膽管癌中HCV C對轉(zhuǎn)錄因子NFAT1的調(diào)控作用,我們通過轉(zhuǎn)染HCV C基因至肝內(nèi)膽管癌RBE細胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細胞中NFAT1 mRNA和蛋白表達水平均較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及空白組顯著增高,而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及空白組之間無明顯差別;同時結(jié)果顯示細胞周期中G1期細胞減少,G2/M及S期細胞增多,提示HCV C可促進RBE細胞的細胞周期進程加快,細胞增殖能力增加。綜上所述,HCV C可能通過Ca2+/CaN/NFAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)NFAT1的表達和生物學(xué)活性,同時影響膽管癌細胞的惡性生物學(xué)行為。

本研究證實, HCV C蛋白可顯著激活膽管癌中的Ca2+/CaN/NFAT信號通路,因此將來可把NFAT1作為藥物或基因治療的一個靶標,通過阻斷引起NFAT1激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或通過抑制NFAT1與靶DNA的結(jié)合活性而達到治療膽管癌的目的。因此該研究或為尋找膽管癌有效的治療手段開辟了新的途徑。

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