源自香糟大黃魚的紅酒糟優(yōu)勢(shì)菌特性及發(fā)酵能力研究
大黃魚享有“國(guó)魚”之美譽(yù),2020年全國(guó)養(yǎng)殖量約25萬(wàn)t,其中福建省產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的81%[1]。發(fā)酵大黃魚是傳統(tǒng)加工產(chǎn)品,具有風(fēng)味獨(dú)特、利于保藏和便于運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)[2]。紅酒糟具有福建省地方特色,含有發(fā)酵后未被利用的粗淀粉、粗蛋白及有機(jī)酸類等物質(zhì),為釀紅曲酒的副產(chǎn)物,對(duì)人體健康和膳食均衡起到一定的作用[3]。香糟大黃魚由原料大黃魚和紅酒糟在密閉環(huán)境下發(fā)酵而成,傳統(tǒng)發(fā)酵多采用手工操作,存在人工經(jīng)驗(yàn)依賴性強(qiáng)、發(fā)酵周期長(zhǎng)、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題。目前,工業(yè)化生產(chǎn)中將紅酒糟與三去(去鱗、去鰓和去內(nèi)臟)魚體復(fù)合,采用層糟層魚、真空包裝、冷凍加工和冷鏈銷售等方式進(jìn)行,基本未進(jìn)行發(fā)酵,風(fēng)味多來(lái)自酒糟自身,難以呈現(xiàn)發(fā)酵魚特有風(fēng)味。因此,篩選優(yōu)勢(shì)微生物及分析其發(fā)酵能力,進(jìn)一步采用現(xiàn)代生物和發(fā)酵工程等技術(shù),通過(guò)強(qiáng)化發(fā)酵劑和優(yōu)化底物等手段,利用微生物間的相互作用使發(fā)酵產(chǎn)品更易消化吸收,以滿足消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)地、安全、風(fēng)味等更高的要求[4-5]。
發(fā)酵魚中優(yōu)勢(shì)菌群受產(chǎn)品類型、生產(chǎn)工藝和生態(tài)因子等影響,其種群類別和發(fā)酵特性均存在差異。ZENG等[6-7]從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚中分離出2株具有抑菌及高酸化活性的植物乳桿菌,接種至魚糜進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)品具有較好的風(fēng)味;并從酸魚中分離酵母菌,探究其耐受性、蛋白水解和脂解活性,用其制作發(fā)酵劑提高了發(fā)酵效能和產(chǎn)品質(zhì)量。賀林娟等[8]將分離的發(fā)酵乳桿菌接種至糟制鰳魚中,采用接種發(fā)酵與傳統(tǒng)工藝相結(jié)合的方法,縮短了發(fā)酵周期的同時(shí)形成了優(yōu)質(zhì)風(fēng)味?;旌暇N接種發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌接種發(fā)酵[9],其模擬自然發(fā)酵中多種微生物的協(xié)調(diào)作用,能夠更好地還原傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味特征。
本研究以源自香糟大黃魚中紅酒糟的優(yōu)勢(shì)菌株為對(duì)象,研究其生理生化、耐受性和碳源利用等基本特征,并以單一菌和復(fù)合菌協(xié)同紅酒糟接種至魚塊中,測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌動(dòng)態(tài)與品質(zhì)變化,以期為香糟大黃魚發(fā)酵劑的制備和傳統(tǒng)發(fā)酵工藝優(yōu)化提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
紅酒糟樣品,采集于寧德市,命名為J。取得樣品后,貯存于無(wú)菌三角瓶中,低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。新鮮大黃魚購(gòu)自福建寧德某公司,層冰層魚,冷鏈運(yùn)至上海,備用。
MRS、PDA培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)股份有限公司;體積分?jǐn)?shù)為3%過(guò)氧化氫酶溶液、葡萄糖產(chǎn)氣生化管、PCA培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;乳酸(食品級(jí)),鄭州高研生物科技有限公司;BUG培養(yǎng)基、FF-IF、IF-A接種液、GEN-III、FF、YT板,美國(guó)Biolog公司;微孔板,芬蘭Bioscreen公司。
1.2 儀器與設(shè)備
濁度計(jì),美國(guó)BIOLOG公司;Bioscreen C微生物生長(zhǎng)曲線分析儀,芬蘭Bioscreen公司;MIR-153高精密度低溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KDN-103F自動(dòng)定氮儀,上海纖檢儀器有限公司;Chroma Meter CR400色差計(jì),日本Minolta公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 微生物的分離純化及鑒定
1.3.1.1 微生物分離純化
取酒糟樣本10 g于無(wú)菌研缽中,加入90 mL生理鹽水,研磨勻漿后進(jìn)行梯度稀釋,選取適宜的稀釋梯度進(jìn)行涂布平板計(jì)數(shù)。菌落總數(shù)、乳酸菌分別采用PCA和MRS培養(yǎng)基,酵母菌和霉菌采用PDA培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)2~3 d。按照菌落形態(tài)學(xué)進(jìn)行分組計(jì)數(shù),3代劃線分離,得到純菌株,4 ℃保藏待用。
1.3.1.2 微生物鑒定
BIOLOG鑒定:將純化后的菌株分別接種至BUG、MRS和PDA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)至可接種狀態(tài)。校準(zhǔn)各接種液透光率為100%;將細(xì)菌接種到IF-A中,調(diào)節(jié)透光率至90%~98%;霉菌接種至FF-IF中,調(diào)節(jié)透光率至73%~77%;酵母菌接種至無(wú)菌生理鹽水,調(diào)節(jié)透光率至45%~49%。將接種液分別加入96孔GEN-III、FF和YT鑒定板中,每孔100 μL,培養(yǎng)48 h后,采用BIOLOG微生物半自動(dòng)鑒定儀鑒定。
分子鑒定:將占比高的菌株經(jīng)反復(fù)分離純化后進(jìn)行鑒定。細(xì)菌鑒定:擴(kuò)增分離菌株16S rDNA,通用引物:27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′);酵母菌鑒定:擴(kuò)增分離菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)域,引物為NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。PCR反應(yīng)體系:Template(基因組DNA 20~50 ng/μL)×0.5 μL;10×Buffer(含Mg2+)×2.5 μL;dNTP(各2.5 mmol/L)×1.0 μL;酶×0.2 μL;F(10 μmol/L)×0.5 μL,R(10 μmol/L)×0.5 μL;加雙蒸水至25.0 μL;PCR循環(huán)條件:預(yù)變性(94 ℃,4 min);30 cycle(94 ℃,45 s;55 ℃,45 s;72 ℃,1 min);修復(fù)延伸(72 ℃,10 min);終止反應(yīng)(4 ℃,∞)。
1.3.2 菌株特性測(cè)定
1.3.2.1 菌株生理生化特征
使用無(wú)菌接種環(huán)挑起單菌落至液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)18~24 h,即為新鮮肉湯培養(yǎng)物,備用。
糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣測(cè)定:吸取50~80 μL新鮮肉湯培養(yǎng)物加入葡萄糖產(chǎn)氣微量西林瓶中,30 ℃培養(yǎng)18~24 h,并按照其說(shuō)明書對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。過(guò)氧化氫酶測(cè)定:使用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落,使菌體置于體積分?jǐn)?shù)3%H2O2溶液中,于30 s內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性,否則為陰性。蛋白酶測(cè)定:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%脫脂奶粉,115 ℃滅菌20 min,倒平板凝固后于培養(yǎng)基上打孔,孔內(nèi)加入新鮮肉湯培養(yǎng)物,靜置培養(yǎng)觀察是否出現(xiàn)透明圈。脂肪酶測(cè)定:基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌后冷卻至80 ℃,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三丁酸甘油酯,倒平板凝固后于培養(yǎng)基上打孔,孔內(nèi)加入新鮮肉湯培養(yǎng)物,靜置培養(yǎng)觀察是否出現(xiàn)透明圈。
將短乳桿菌以1%接種量接種至未添加NaCl及添加2%、4% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中,測(cè)定24 h的pH以評(píng)價(jià)產(chǎn)酸能力。NaCl和pH對(duì)短乳桿菌和釀酒酵母生長(zhǎng)的影響中,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、4%、6%、8%),pH(3、5、7);乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置為1%、3%、5%、7%。依照各因子配制相應(yīng)的MRS和PDA無(wú)菌接種液,微孔板中每孔加入180 μL接種液,取約104CFU/mL濃度的菌懸液20 μL接種至孔中,平行實(shí)驗(yàn)數(shù)為5,以無(wú)菌接種液為對(duì)照。將微孔板放入微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀中中速振蕩,每1 h測(cè)定其OD600 nm值,共5 d。
1.3.2.2 碳源利用特征
前處理方法同1.3.1.2中的BIOLOG鑒定,通過(guò)微生物對(duì)微孔板中的不同碳源利用及氧化情況進(jìn)行測(cè)試,按照使用手冊(cè)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。
1.3.3 發(fā)酵能力測(cè)定
1.3.3.1 魚塊制備及接種
魚塊處理:鮮大黃魚去內(nèi)臟,去皮后取背脊處魚肉,分割至規(guī)格一致,在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌水沖洗,晾干備用;菌懸液制備:菌株活化后分別在平板內(nèi)劃線,30 ℃培養(yǎng)24~48 h得到單菌落,挑取單菌落至100 mL無(wú)菌液體培養(yǎng)基中,30 ℃搖床培養(yǎng)18~24 h后,MRS中菌懸液濃度約109 CFU/mL,YPD液體培養(yǎng)基中約108 CFU/mL,經(jīng)多次離心、洗滌,重懸于無(wú)菌生理鹽水中,調(diào)整濃度約為107 CFU/mL,備用。
接種:取上述魚塊、菌懸液和紅酒糟,按魚塊的質(zhì)量進(jìn)行菌懸液的接種和紅酒糟的添加。實(shí)驗(yàn)共分4組,A組:添加紅酒糟,層糟層魚擺放;B組:添加短乳桿菌(2%)及紅酒糟;C組:添加釀酒酵母(2%)及紅酒糟;D組:添加短乳桿菌(1%)、釀酒酵母(1%)及紅酒糟。上述紅酒糟的添加量均為m(魚塊)∶m(紅酒糟)=1∶1,各組均采用無(wú)菌高溫蒸煮袋進(jìn)行包裝,密封后20 ℃條件下發(fā)酵7 d,每24 h進(jìn)行測(cè)定。
1.3.3.2 感官評(píng)定
參照賀林娟等[8]的方法,由具有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)及專業(yè)背景人員組成感官評(píng)定小組,在外觀、質(zhì)地和風(fēng)味3個(gè)方面對(duì)香糟大黃魚進(jìn)行感官評(píng)定,其中風(fēng)味權(quán)重為40%,色澤和質(zhì)地均為30%,評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1。
表1 香糟大黃魚感官評(píng)定表
Table 1 Standards of sensory evaluation for vinasse large yellow croaker

1.3.3.3 菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及模型評(píng)價(jià)
每組稱取10 g魚肉樣品置于無(wú)菌生理鹽水中,研磨后進(jìn)行梯度稀釋,選擇合適的稀釋梯度進(jìn)行涂布,菌落總數(shù)、乳酸菌及酵母菌分別采用PCA、MRS和PDA培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)2~3 d后計(jì)數(shù)。
模型構(gòu)建:采用修正的Gompertz方程擬合菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線,見公式(1):

式中:Nt,t時(shí)間對(duì)應(yīng)的菌數(shù),CFU/g;N0,初始菌數(shù),CFU/g;Nmax,最大菌數(shù),CFU/g;μmax,最大比生長(zhǎng)速率,h-1;t,時(shí)間,d;Lag,延滯期,h。
模型評(píng)價(jià):采用判定系數(shù)(R2)、均方誤差(root mean square error,RMSE)、偏差因子(Bf)和準(zhǔn)確因子(Af)對(duì)模型擬合優(yōu)度進(jìn)行評(píng)價(jià),其中R2、Af和Bf值越接近于1,RMSE越接近于0,預(yù)測(cè)效果越好,評(píng)價(jià)方程如公式(2)(3)(4)所示。

式中:yobs,實(shí)測(cè)值;ycal,預(yù)測(cè)值;n,實(shí)測(cè)值個(gè)數(shù)。
1.3.3.4 色澤測(cè)定
取發(fā)酵大黃魚魚塊,使用色差計(jì)進(jìn)行測(cè)定,記錄L*值、a*值、b*值。
1.3.3.5 理化指標(biāo)的測(cè)定
pH、總酸(total acid,TA)、氨基態(tài)氮(amino acid nitrogen,ANN)、總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)測(cè)定分別按照GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》、GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》(酸堿滴定法、以乳酸計(jì))、甲醛滴定法、GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。
1.4 數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及計(jì)算,使用Origin 8.0作圖,并按照修正Gompertz模型進(jìn)行擬合。
2 結(jié)果與分析
2.1 優(yōu)勢(shì)菌鑒定及其生理生化和碳源利用特征
經(jīng)分離、純化、BIOLOG鑒定和分子鑒定,研究發(fā)現(xiàn),紅酒糟中微生物由乳酸菌、酵母菌、芽胞桿菌等組成,如圖1所示。

圖1 紅酒糟中微生物菌相組成
Fig.1 Microbial phase composition in red vinasse
由圖2可知,J4-1與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的相似度為100%, J3-1與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相似度99%, 且二者為紅酒糟中的優(yōu)勢(shì)菌, 占比分別為55.28%和41.74%。

a-細(xì)菌;b-酵母菌
圖2 優(yōu)勢(shì)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.2 Phylogenetic tree of dominant strains
短乳桿菌和釀酒酵母生理生化和碳源利用特征見表2,短乳桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,釀酒酵母具有過(guò)氧化氫酶活性,可清除發(fā)酵過(guò)程中過(guò)氧化氫造成的酸敗。短乳桿菌具有脂肪酶活力,能通過(guò)酯的水解、合成、交換形成特殊風(fēng)味;但也有研究表明應(yīng)用于發(fā)酵肉制品中的乳酸菌無(wú)需脂肪酶和蛋白酶活性,否則會(huì)產(chǎn)生酸敗味[10]。
乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中積累有機(jī)酸,降低pH,抑制病原微生物以減少危害[11],一般要求在16~24 h內(nèi)使發(fā)酵體系pH降到5.3以下[12],在本研究中37 ℃培養(yǎng)24 h及NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和4%條件下,pH均能下降到5.0以下?;旌习l(fā)酵中酵母菌通常與乳酸菌復(fù)配使用,因此酵母菌必須能夠具有低酸耐受性并有較高的活性使發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行,釀酒酵母在pH 3~7時(shí)能生長(zhǎng),對(duì)酸性環(huán)境有一定的耐受性。在提倡低鹽健康生活的當(dāng)下,通過(guò)接種乳酸菌發(fā)酵劑,并輔以低氧脅迫,控制有害微生物的生長(zhǎng),使發(fā)酵魚制品的安全性得到保障[13];NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%~6%滿足在發(fā)酵制品中乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)6%食鹽耐受性的要求;隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至8%,酵母菌仍能夠生長(zhǎng)。乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%~5%時(shí),釀酒酵母均能生長(zhǎng),乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至7%,生長(zhǎng)受到抑制。已有研究表明乳酸菌和酵母菌之間存在信號(hào)分子,能促進(jìn)或者抑制彼此生長(zhǎng)[14],本研究中的釀酒酵母與短乳桿菌在共培養(yǎng)中的相互作用還需進(jìn)一步的研究。
碳源可供給微生物生命活動(dòng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量。由表2可知,2株菌利用的碳源物質(zhì)種類差異較大,呈互補(bǔ)狀,短乳桿菌能利用α-D-葡萄糖,此糖為六碳糖,研究表明乳酸菌利用五碳糖、六碳糖代謝后可產(chǎn)生有機(jī)酸,除對(duì)滋味的貢獻(xiàn)外,還能與酵母菌產(chǎn)生的醇類相互作用生成酯類,增強(qiáng)風(fēng)味。釀酒酵母可利用多種類型碳源,具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力,并且在生成物質(zhì)中,醇類和酯類能使發(fā)酵制品更加溫和濃郁。
表2 短乳桿菌和釀酒酵母生理生化和碳源利用特征
Table 2 Biochemical characterization and carbon source utilization of Lactobacillus brevis and S. cerevisiae

注:“+”表示呈陽(yáng)性;“-”表示呈陰性;“/”表示該項(xiàng)無(wú)對(duì)應(yīng)內(nèi)容
2.2 發(fā)酵能力
2.2.1 感官評(píng)定
各組樣品感官綜合得分見圖3,在發(fā)酵前3 d,各組樣品間的感官評(píng)分無(wú)明顯差異,4 d后差異逐漸顯現(xiàn),接種復(fù)合菌株的樣品組評(píng)分大于接種單一菌的發(fā)酵魚樣品。酵母菌和乳酸菌進(jìn)行混合培養(yǎng)后,其產(chǎn)生的代謝物具有互補(bǔ)機(jī)制,能夠促進(jìn)有機(jī)酸、游離氨基氮等含量的提高,從而利于增強(qiáng)風(fēng)味[14]。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的加入促進(jìn)紅酒糟中的刺激氣味逐漸變得柔和,提升了發(fā)酵大黃魚的風(fēng)味品質(zhì)。
2.2.2 微生物分析
乳酸菌和酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力模型評(píng)價(jià)參數(shù)見表3,該生長(zhǎng)模型擬合優(yōu)度良好。

A-添加紅酒糟;B-添加紅酒糟及短乳桿菌; C-添加紅酒糟及釀酒酵母;D-添加紅酒糟、 短乳桿菌及釀酒酵母(下同)
圖3 大黃魚發(fā)酵過(guò)程中的感官綜合得分
Fig.3 Sensory comprehensive score of large yellow croaker during fermentation
表3 乳酸菌和酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型評(píng)價(jià)
Table 3 Evaluation of lactic acid bacteria and yeast growth kinetic models

圖4為大黃魚發(fā)酵過(guò)程中微生物的變化,在發(fā)酵過(guò)程中,菌落總數(shù)整體處于較低狀態(tài),D組樣品中菌落總數(shù)最低僅為2.70 lg CFU/g,推測(cè)由于紅酒糟具有較低的pH并含有抑菌物質(zhì),進(jìn)一步抑制了雜菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵魚中接種短乳桿菌和釀酒酵母后,其相應(yīng)生長(zhǎng)曲線整體呈“S”型。

a-菌落總數(shù);b-乳酸菌總數(shù);c-酵母菌總數(shù)
圖4 大黃魚發(fā)酵過(guò)程中微生物的變化
Fig.4 Microbiological changes in large yellow croaker during fermentation
由表4所示乳酸菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)中可知,由于A和C樣品未接種短乳桿菌,乳酸菌均來(lái)自于紅酒糟,此時(shí)兩者μmax無(wú)明顯差別,B和D樣品由于接入短乳桿菌,故其μmax顯著大于A和C樣品的μmax,且B樣品的μmax顯著大于D,接入復(fù)合菌后乳酸菌延滯期變短。酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)中A組和B組中未接入釀酒酵母,酵母菌均來(lái)自紅酒糟,此時(shí)兩者μmax無(wú)明顯差別;C和D中由于接入釀酒酵母,故其μmax大于A和B樣品,且接入復(fù)合菌后酵母菌延滯期變長(zhǎng)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)條件下雖然低含量的乳酸能夠促進(jìn)釀酒酵母的生長(zhǎng),但在魚塊中進(jìn)行短乳桿菌和釀酒酵母的混合發(fā)酵,短乳桿菌和釀酒酵母的實(shí)際生長(zhǎng)情況可能還受其他復(fù)雜因素的影響[15]。
2.2.3 色差分析
由于紅酒糟中含有紅曲霉菌產(chǎn)生的紅曲色素,故其在發(fā)酵過(guò)程中賦予了魚肉誘人及獨(dú)特的色澤。由圖5可知,在發(fā)酵過(guò)程中魚肉L*值逐漸下降,同樣在王乃富等[16]研究中鳙魚肉糜經(jīng)紅曲霉發(fā)酵后L*值明顯降低。添加紅酒糟及接種菌株后a*值、b*值顯著提升,魚肉表現(xiàn)出良好的色澤。樣品D在發(fā)酵結(jié)束時(shí)表現(xiàn)出最高的紅度值和黃度值,且添加釀酒酵母和短乳桿菌后的B、C和D樣品的a*值均大于A樣品,說(shuō)明短乳桿菌和釀酒酵母的加入有助于發(fā)酵魚塊中紅色色澤的形成。在魚塊發(fā)酵過(guò)程中b*值波動(dòng)較a*值大,B組和C組在發(fā)酵第2天時(shí)b*值達(dá)到最大,發(fā)酵后期逐漸降低后平穩(wěn)??傮w上,添加紅酒糟組a*值總體在25左右波動(dòng),b*值在20左右波動(dòng),表明紅酒糟發(fā)酵大黃魚逐漸呈現(xiàn)了其區(qū)別于其他發(fā)酵產(chǎn)品的紅亮色色澤。綜上所述,在添加復(fù)合菌株和紅酒糟后的發(fā)酵大黃魚塊能夠形成良好的色澤,提升了發(fā)酵大黃魚的品質(zhì)。
表4 乳酸菌和酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)
Table 4 Growth kinetic parameters of lactic acid bacteria and yeast

2.2.4 pH和TA含量變化
大黃魚發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸含量的變化見圖6,由于紅酒糟本身具有較低的pH,發(fā)酵第1天,pH已下降至較低的狀態(tài),在后續(xù)發(fā)酵中處于波動(dòng)狀態(tài)。

a-L*;b-a*;c-b*
圖5 大黃魚發(fā)酵過(guò)程中色差的變化
Fig.5 The color changes of large yellow croaker during fermentation

a-pH;b-總酸
圖6 大黃魚發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸含量的變化
Fig.6 Total acid changes of large yellow croaker during fermentation
發(fā)酵肉制品中前48 h的環(huán)境條件對(duì)有害病原體的生長(zhǎng)和隨后的存活率至關(guān)重要,此外低pH值引起的蛋白聚集有利于提升發(fā)酵產(chǎn)品的穩(wěn)定性和緊實(shí)性,還可以抑制生物胺的形成,提高產(chǎn)品安全性。各樣品在發(fā)酵過(guò)程中總酸含量逐漸增高,在發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定;其中短乳桿菌實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵前期,其總酸含量略高于其他實(shí)驗(yàn)組,但在發(fā)酵后期接種復(fù)合菌實(shí)驗(yàn)組總酸含量略高。
2.2.5 ANN含量變化
蛋白質(zhì)、多肽等含氮化合物在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)逐漸降解成小分子肽、游離氨基酸等物質(zhì)[17],可指示ANN含量的變化,見圖7。發(fā)酵前期ANN的含量均呈上升趨勢(shì),而后未接種菌株和接種釀酒酵母實(shí)驗(yàn)組氨基態(tài)氮含量逐漸下降,裘迪紅等[18]指出氨基態(tài)氮為蛋白質(zhì)的中間降解產(chǎn)物,可進(jìn)一步代謝為小分子物質(zhì),故呈先增加后降低的趨勢(shì)。短乳桿菌的接入可以明顯增加ANN的含量,其蛋白質(zhì)的降解是內(nèi)源蛋白酶和微生物酶共同作用的結(jié)果,而這2種因素對(duì)蛋白水解的貢獻(xiàn)還有待研究[19]。

圖7 大黃魚發(fā)酵過(guò)程中氨基態(tài)氮含量的變化
Fig.7 Amino nitrogen changes in large yellow croaker during fermentation
2.2.6 TVB-N含量變化
TVB-N值與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨以及胺類等含氮物質(zhì)的含量呈正相關(guān),與水產(chǎn)品品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)[20]。由圖8所示,在各實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵魚中TVB-N在接種1 d后均已達(dá)到較高水平,可能是發(fā)酵過(guò)程中紅酒糟的液態(tài)基質(zhì)滲透到魚肉組織中,使得所檢測(cè)的魚肉中的TVB-N含量處于較高的狀態(tài)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)TVB-N含量下降,推測(cè)酒糟發(fā)酵所造成的酸性環(huán)境抑制了酶活性和蛋白質(zhì)分解;另外在BAO等[21]的研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵肉制品中乳酸菌可通過(guò)其產(chǎn)生的乳酸和細(xì)菌素來(lái)中和揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì),從而抑制TVB-N的積累。

圖8 大黃魚發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化
Fig.8 Total volatile basic nitrogen changes in large yellow croaker during fermentation
3 結(jié)論
以源自香糟大黃魚中紅酒糟優(yōu)勢(shì)菌短乳桿菌和釀酒酵母為對(duì)象,分析了2種菌的生理生化、碳源代謝和發(fā)酵能力,表明短乳桿菌具有良好的酸化能力、低pH耐受性和高NaCl耐受性;釀酒酵母具有低pH、高NaCl及乳酸耐受性;2種菌碳源代謝類型差異較大。在接種實(shí)驗(yàn)中,接種釀酒酵母能夠使紅酒糟中的刺激氣味逐漸變得柔和;紅酒糟可抑制雜菌的增殖,提供良好安全的環(huán)境,且發(fā)酵大黃魚逐漸呈現(xiàn)了區(qū)別于其他發(fā)酵產(chǎn)品的紅亮色澤。短乳桿菌的接入可加速發(fā)酵,增加氨基態(tài)氮的含量;短乳桿菌和釀酒酵母均可抑制大黃魚中腐敗菌的生長(zhǎng),降低發(fā)酵中產(chǎn)品的腐敗變質(zhì),但對(duì)其抑制效應(yīng)和評(píng)價(jià)有待深入研究。
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