生花和不生花泡菜鹽水真菌群落結(jié)構(gòu)的對比

重慶市是著名的泡菜之鄉(xiāng)，很多家庭保持了使用泡菜壇和傳統(tǒng)方法自制泡菜的習俗。傳統(tǒng)泡菜制作的特點是在室溫下發(fā)酵，由于泡菜壇有壇沿和水封結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)厭氧發(fā)酵，并且鹽水一直留存于壇內(nèi)持續(xù)發(fā)酵蔬菜數(shù)年甚至超過十年[1-2]。不同家庭由于食用的喜好而泡制的蔬菜品種存在差異，再加上具體的操作習慣、地域、環(huán)境等因素，自制泡菜富有多樣性。通常衡量泡菜好壞的一個重要因素是鹽水。優(yōu)質(zhì)鹽水清徹透明，顏色淡黃，散發(fā)蔬菜自然的清香，可持續(xù)發(fā)酵產(chǎn)出濃厚地道風味的泡菜。劣質(zhì)鹽水反復(fù)出現(xiàn)“生花”現(xiàn)象，表現(xiàn)為鹽水渾濁，有白色膜、團塊或者顆粒漂浮于液面，有可能引起泡菜的異味或者變質(zhì)。

目前關(guān)于生花現(xiàn)象的研究多集中于分離鑒定相關(guān)的微生物種類，主要的微生物是真菌，包括Pichia、Candida、Debaryomyces和Galactomyces屬[3-7]，生花是一種生物膜的現(xiàn)象，可能是酵母細胞彼此黏附，聚集在氣液交界面，形成膜或者顆粒[6]。目前很少研究從鹽水微生物群落結(jié)構(gòu)的整體角度進行分析。鹽水質(zhì)量的好壞可能與其中的微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)。重慶泡菜的“老”鹽水一般經(jīng)歷過數(shù)年的持續(xù)發(fā)酵，其間由于不斷添加蔬菜或者環(huán)境等因素引入微生物，其中的微生物種類非常豐富，在長期發(fā)酵過程中形成具有一定動態(tài)平衡和穩(wěn)定性的微生物群落結(jié)構(gòu)，抵抗新進入的微生物，維持原有的菌種構(gòu)成和豐度。因而優(yōu)質(zhì)的鹽水能夠持續(xù)保持優(yōu)良的發(fā)酵性能，而“生花”的鹽水則反復(fù)出現(xiàn)生花的現(xiàn)象。本論文采用Illumina MiSeq測序技術(shù)解析生花和不生花的優(yōu)質(zhì)鹽水的真菌群落結(jié)構(gòu)，對比它們之間的差異，分析相關(guān)的微生物信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料

采集重慶市涪陵區(qū)、渝北區(qū)、長壽區(qū)、墊江縣、梁平區(qū)、武隆區(qū)連續(xù)發(fā)酵10年以上的家庭自制泡菜老鹽水。取有明顯的生花現(xiàn)象的鹽水樣品8份，記為生花組(P組)；8份無生花現(xiàn)象鹽水樣品，記為不生花組(non-pellicle，NP組)，部分樣品照片如圖1所示。

a-生花；b-不生花
圖1 生花和不生花泡菜鹽水樣品照片
Fig.1 Pictures of Paocai brine samples with and without pellicle phenomenon

將樣品裝入已滅菌的樣品瓶，置于有冰袋的保溫箱中運回實驗室。

1.1.2 藥品試劑

硝酸銀標準溶液(0.100 0 mol/L)，天津渤化化學試劑有限公司；Premix Taq、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、RNase-free Water、pMD19-T Vecter Cloning Kit、DL2000DNA Ladder Marker、E.coli Competent Cells JM109，寶生物工程(大連)有限公司；DNeasy mericon Food Kit (69514)，德國Qiagen公司。引物序列如表1所示，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列
Table 1 The sequence of primers

1.1.3 儀器設(shè)備

HBM-400D拍擊式均質(zhì)儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；CFX96 Real-time PCR儀、T100 PCR儀、Power pacbasic電泳儀，美國Bio-Rad公司；G:BOXEF凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司；P100/P100+超微量分光光度計，美國Pultton公司；Mini-Q超級純水儀，法國Synergy公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 理化分析

泡菜鹽水的pH值、可滴定酸、鹽濃度、有機酸采用本實驗室建立的方法檢測[8]。亞硝酸鹽濃度采用GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》檢測。

1.2.2 DNA的提取

將泡菜水均質(zhì)，取20 mL以7 000×g轉(zhuǎn)速離心15 min收集微生物沉淀顆粒，用1ⅹTE buffer洗滌沉淀顆粒，然后用DNeasy mericon food kit試劑盒按照說明書的步驟提取微生物的宏基因組DNA[8,10]。用P100/P100+超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.2.3 qPCR法測定真菌的數(shù)量

用real-time PCR方法檢測泡菜水中真菌數(shù)量。將標準菌株Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763的ITS基因片段與質(zhì)粒載體pMD19-T連接，構(gòu)建標準質(zhì)粒和標準曲線。qPCR反應(yīng)體系組成是：12.5 μL premix buffer，0.5 μL Y1和 Y2引物 (10 mmol/L)，2 μL DNA，補水至25 μL。qPCR反應(yīng)程序是：94 ℃預(yù)變性45 s；94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，45次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min[8,11]。每個檢測做3次平行。

1.2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)

提取的微生物宏基因組DNA送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，運用Illumina MiSeq PE300平臺、ITS1F和ITS2R引物對真菌的ITS1區(qū)測序[8]。原始序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控[12]，用FLASH軟件進行拼接[13]：(1)設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；(2)barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基；(3)根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需>10 bp。去除無法拼接的序列。將獲得的高質(zhì)量序列采用QIIME包(quantitative insights into microbial ecology，定量研究微生物群落，version 1.9.1)[14]做生物信息分析。用UCLUST對序列在97%的相似度水平下進行聚類，獲得分類操作單元(operational taxonomic units，OTUs)[15]，將ITS序列基于Unite(unite7.0/its_fungi，Release 7.0，http://unite.ut.ee/index.php)[16]真菌數(shù)據(jù)庫進行比對，比對閾值均為70%，得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，生成不同分類水平上的物種豐度表。用QIIME計算α多樣性指數(shù)Sobs、Shannon、Simpson、Chao1、coverage。用R語言繪制Shannon指數(shù)圖、物種構(gòu)成圖(門和屬水平)、偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)圖，用Kruskal Wallis檢驗兩組樣品在屬水平的物種差異并且繪制箱線圖。用R語言的ggcorrplot包計算兩組樣品真菌群落結(jié)構(gòu)與理化數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性系數(shù)(Pearson相關(guān))和繪制熱圖。部分數(shù)據(jù)分析在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger免費在線云平臺中完成(https://www.i-sanger.com/)。

1.2.5 NCBI序列號

本研究中真菌的ITS1序列被存入NCBI的Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，序列注冊號為：No.PRJNA551794。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的信息、理化數(shù)據(jù)和生物量

表2列出了樣品的采樣信息及理化數(shù)據(jù)(pH值、可滴定酸、鹽、亞硝酸鹽和有機酸含量)和真菌生物量，分別計算了P和NP組數(shù)據(jù)的范圍、平均值，采用獨立樣本t檢驗比較兩組數(shù)據(jù)的差異，理化數(shù)據(jù)的差異不顯著，真菌生物量的差異顯著，P組樣品真菌的平均拷貝數(shù)幾乎是NP組的20倍，由此推測某些種類的真菌大量繁殖引起生花現(xiàn)象。趙慧君等[17]采用PCR-DGGE和培養(yǎng)法研究了襄陽大頭菜正常和長膜醭腌制液中的真菌，發(fā)現(xiàn)2種腌制液酵母菌的種類相同且單一，均為魯氏酵母和漢遜德巴利酵母，在有膜醭的大頭菜腌制液中，魯氏酵母和漢遜德巴利酵母的生物量顯著增加，推斷襄陽大頭菜中的膜醭可能是由于魯氏酵母和漢遜德巴利酵母的過度繁殖造成的，與本研究的結(jié)果和分析相似。MOON等[18]用平板計數(shù)法檢測了韓國泡菜(kimchi)的生物膜形成過程中酵母的菌落總數(shù)，無論是粗糙型(R)還是光滑型(S)的菌落，其數(shù)量都呈明顯的上升趨勢，也能映證真菌數(shù)量的增加與生花現(xiàn)象有關(guān)。

表2 泡菜鹽水樣品的采樣信息、生化指標和真菌生物量檢測結(jié)果
Table 2 The information, chemical characteristics and fungal biomass of Paocai brine samples

*表示P和NP組之間真菌生物量存在顯著性差異(獨立樣本t-檢驗)* P<0.05

2.2 Illumina MiSeq測序的基本數(shù)據(jù)和α多樣性指數(shù)

采用Illumina MiSeq對泡菜鹽水樣品中的真菌多樣性測序，測序的基本信息和α多樣性指數(shù)如表3所示。所有樣品的coverage均達到1.000，表示測序數(shù)據(jù)幾乎覆蓋了樣品中所有的物種信息。采用獨立樣本t檢驗，P和NP組之間的4個α多樣性指標(Sobs、Shannon、Simpson、Chao1)不存在顯著性差異。

表3 泡菜鹽水樣品真菌多樣性測序的基本信息和α多樣性指數(shù)
Table 3 The basic information and α diversity indices of fungal community structure in Paocai brine samples with the use of Illumina MiSeq sequencing technology

續(xù)表3

圖2為鹽水樣品的真菌群落在OTU水平的Shannon指數(shù)曲線圖，當reads數(shù)達到1 600 以上時，Shannon曲線達到了飽和狀態(tài)，提示真菌的測序深度是足夠的。

圖2 泡菜鹽水樣品中真菌群落的Shannon 多樣性指數(shù)曲線圖
Fig.2 The Shannon diversity index curve of fungal community in Paocai brine samples

2.3 P和NP組真菌的群落結(jié)構(gòu)

本研究采用Illumina MiSeq測序獲得了P和NP組樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)信息。總的來說，16個樣品的序列被劃分為386個OTU，鑒定為5個門和161個屬，其中P組有177個OTU、5個門、74個屬，NP組有286個OTU、5個門、140個屬，兩個組共有77個OTU、5個門和53個屬。

P組中優(yōu)勢的門(平均相對豐度>1%，圖3-a)有：Ascomycota(96.38%)、Basidiomycota(1.83%)。NP組優(yōu)勢的門有：Ascomycota(98.07%)、Basidiomycota(1.44%)。Ascomycota在15個樣品中的相對豐度都超過90%，在樣品P3中的豐度也高達83.98%，因此它是最優(yōu)勢的門。

P組優(yōu)勢的屬(平均相對豐度>1%，圖3-b)包括Pichia(85.22%)、Candida(2.07%)、Aspergillus (1.54%)、Fusarium(1.25%)。NP組優(yōu)勢的屬有Pichia(46.04%)、Debaryomyces(21.75%)、Aspergillus (9.57%)、Kazachstania(5.31%)、Simplicillium(2.72%)、Penicillium(1.43%)、Wickerhamomyces(1.32%)、Fusarium(1.15%)、Candida(1.04%)、Schwanniomyces(1.03%)。Pichia是P組8個樣品中相對豐度最高的屬，它在P1和P3中的豐度分別是68.17%、41.47%，在其余6個樣品中的豐度都超過了90%。NP組不同樣品的優(yōu)勢菌屬差異比較大，Pichia是樣品NP1、NP3、NP5、NP6中最優(yōu)勢的菌屬，其百分比分別為84.06%、93.10%、96.97%、94.19%。Debaryomyces是樣品NP4、NP7和NP8中最優(yōu)勢的屬，相對豐度分別為50.06%、48.06%、59.53%。樣品NP2的優(yōu)勢屬是Aspergillus(32.47%)。除了Trichosporon和未鑒定的屬, 從P組中檢出的屬在NP組中也存在。

a-門水平；b-屬水平
圖3 P和NP組泡菜鹽水樣品中真菌群落在門、 屬水平上的種類構(gòu)成圖
Fig.3 The composition of fungal community at phylum and genus levels in Paocai brine samples of groups P and NP 注：others，將平均相對豐度小于1%的門、屬的 相對豐度歸并為others；unclassified，未鑒定的門、屬

2.4 P和NP組真菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平的差異

如PLS-DA圖(圖4)所示，P與NP組的點呈現(xiàn)明顯的分別聚類現(xiàn)象，提示兩組的真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著的差異。進一步用Kruskal Wallis檢驗分析得出兩組樣品中存在顯著性差異的屬為Debaryomyces和Kazachstania，如圖5所示。從P組樣品中沒有檢出Debar-yomyces和Kazachstania屬，而在NP組樣品中，Debaryomyces是最主要的屬，Kazachstania的豐度也比較高。

圖4 P和NP組泡菜鹽水樣品中真菌群落在屬 水平上的PLS-DA圖
Fig.4 PLS-DA graphs of fungal community in Paocai brine samples of groups P and NP at genus level

Debaryomyces屬的菌株能夠產(chǎn)生一種毒素，抑制成膜酵母菌的生長[19]，可能是一個潛在的阻止“花”形成的因素。

2.5 P和NP組真菌群落結(jié)構(gòu)與理化指標的相關(guān)性分析

圖6為P和NP組真菌群落結(jié)構(gòu)與理化指標的相關(guān)性熱圖。在P組中，鹽濃度與Fusarium、Candida顯著正相關(guān)，琥珀酸與Penicillium、Simplicillium、Aspergillus顯著正相關(guān)，與Pichia顯著負相關(guān)。在NP組中，真菌生物量與鹽濃度之間顯著負相關(guān)，Aspergillus、Simplicillium、Penicillium與pH值顯著負相關(guān)。

圖5 P和NP組泡菜鹽水樣品的真菌群落中存在 顯著性差異的屬
Fig.5 The genera with significant differences in the fungal community between P and NP groups of Paocai brine samples

鹽濃度和酸(pH值、可滴定酸)通常是對泡菜鹽水中微生物影響比較大的理化指標。根據(jù)圖6，在NP組中，鹽濃度與真菌生物量呈顯著負相關(guān)，pH值與Aspergillus、Simplicillium、Penicillium相對豐度顯著負相關(guān)，而在P組中，鹽濃度與真菌生物量沒有顯著的相關(guān)性，而是與Fusarium、Candida顯著正相關(guān)，pH值與真菌屬之間也沒有顯著相關(guān)性，提示鹽濃度和酸對真菌豐度的影響降低?，F(xiàn)有文獻報道從鹽廠的高濃度鹽水中分離出的Candida屬菌株具有較強的耐鹽性[20]，這可能是Candida的相對豐度與鹽濃度呈正相關(guān)的原因。

圖6 P和NP組泡菜鹽水樣品中主要的真菌菌屬與理化數(shù)據(jù)的相關(guān)性熱圖(Pearson相關(guān))
Fig.6 The correlation heat-map between major fungal genera and physicochemical data in P and NP groups of Paocai brine samples (Pearson correlation)

從P組樣品中檢出的大部分屬在NP組中也存在，即兩組樣品中真菌的屬大部分是相同的。另一方面，real-time PCR的結(jié)果表明P組(生花)真菌的平均生物量(拷貝數(shù))幾乎是NP組(不生花)的20倍。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq測序技術(shù)解析了生花(P組)和不生花(NP組)鹽水樣品中真菌的群落結(jié)構(gòu)。P組樣品中主要的屬包括：Pichia(85.22%)、Candida(2.07%)、Aspergillus(1.54%)、Fusarium(1.25%)，NP組主要的屬包括：Pichia(46.04%)、Debaryomyces(21.75%)、Aspergillus(9.57%)、Kazachstania(5.31%)、Simplicillium(2.72%)、Penicillium(1.43%)、Wickerhamomyces(1.32%)、Fusarium(1.15%)、Candida(1.04%)、Schwanniomyces(1.03%)。P組真菌的平均生物量(拷貝數(shù))幾乎是NP組的20倍。Kruskal Wallis檢驗發(fā)現(xiàn)兩組的Debaryomyces和Kazachstania相對豐度存在顯著性差異。分析推測生花現(xiàn)象可能與真菌數(shù)量的增加有關(guān)，NP組樣品中Debaryomyces的存在可能是一個潛在的阻止“花”形成的因素。