美極梅奇酵母冷凍干燥復合保護劑的優(yōu)化研究

冷凍干燥菌劑具有活性高、穩(wěn)定性強以及能有效預防變質(zhì)和污染細菌等優(yōu)點[1-2]。為提高冷凍干燥過程中細胞的存活率，通常加入保護劑以提高細胞對外界壓力的抵抗力[3]。海藻糖、脫脂牛奶、蔗糖、乳糖、葡聚糖、麥芽糖、甘露醇、麥芽糊精、阿拉伯膠和淀粉等糖和碳水化合物以及蛋白質(zhì)被廣泛應用于細胞的凍干過程[4]。但單一保護劑對細胞的保護作用非常有限，需要其他保護劑的協(xié)同作用來提高細胞的存活率[5]。因此，在細胞凍干過程中通常添加復合保護劑，以達到冷凍過程中對細胞更好的保護作用[6-7]。POLOMSKA等[8]研究發(fā)現(xiàn)，凍干假絲酵母時，采用脫脂奶粉、海藻糖和谷氨酸鈉作保護劑比僅使用脫脂奶粉作為保護劑酵母存活率提高了60%。

美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima，Mp)是一種常見的非釀酒酵母，普遍存在于成熟葡萄漿果表面和葡萄酒發(fā)酵初級階段[9]。Mp與釀酒酵母混菌發(fā)酵，具有降低葡萄酒酒精含量、增加甘油含量[10]、改善葡萄酒的風味和品質(zhì)[11-12]、促進紅葡萄酒色澤穩(wěn)定性[13]等良好釀造特性[14-15]。因此，其在果酒釀造中具有非常廣泛的應用前景。我國釀造菌劑的研發(fā)遠落后于國外相關(guān)研究，且國內(nèi)果酒釀造菌劑主要依賴進口。所以，專一性菌劑的缺乏，是導致國內(nèi)葡萄酒同質(zhì)化問題嚴重、口感寡淡缺乏特色的關(guān)鍵。因此，開發(fā)高效菌劑是提升果酒風味和品質(zhì)的關(guān)鍵，也是提升果蔬精加工產(chǎn)品附加值的重要手段。為了促進Mp發(fā)酵劑的商業(yè)化及推廣其廣泛應用，有必要開展高穩(wěn)定性及高存活率Mp菌劑的制備方法和技術(shù)等相關(guān)研究。目前雖已有文獻報道了異常漢遜酵母(Hansenula anormala)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)等少數(shù)非釀酒酵母冷凍干燥保護劑的研究[6,16]，并對保護劑的保護機理進行了初步探討，為非釀酒酵母冷凍干燥菌劑的開發(fā)提供了參考。但研究發(fā)現(xiàn)，不同物種甚至同一物種的不同菌株在真空冷凍干燥及其儲存期間表現(xiàn)出不同的行為[17]。因此，目前有關(guān)非釀酒酵母冷凍干燥菌劑及其保護劑的開發(fā)還需要開展廣泛的研究。同時，有關(guān)Mp菌劑的開發(fā)及其冷凍復合保護劑的研究還鮮見報道。

本研究采用Plackett-Burman試驗設(shè)計法篩選出對Mp冷凍干燥具有顯著保護作用的保護劑，結(jié)合最陡爬坡試驗和響應面分析法(response surface method,RSM)進一步優(yōu)化保護劑復合配方，以期最大限度提高該酵母在冷凍干燥過程中的存活率，為未來實現(xiàn)Mp發(fā)酵劑工業(yè)化的制備和應用提供參考，也為其他酵母冷凍干燥保護劑的研究和開發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美極梅奇酵母(Mp 01)，由河北科技師范學院釀酒工程實驗室保藏。

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20，121 ℃滅菌20 min。

YEPD固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20、瓊脂 20，121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉，山東億寶萊生物科技有限公司；谷氨酸鈉和海藻糖，河南萬邦實業(yè)有限公司；麥芽糖，成都市科龍化工試劑廠；蔗糖，天津市風船化學試劑科技有限公司；乳糖、甘氨酸、維生素C，上海源葉生物科技生物有限公司；吐溫-80，阿拉丁。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1 200 EYELA真空冷凍干燥機，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；低溫離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SW-CJ 系列潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS-2F數(shù)顯恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇區(qū)水北科普實驗儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 美極梅奇酵母生長曲線及菌體收集時間的確定

菌種的活化：適量挑取斜面菌種接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，得活化種子液，并用血球計數(shù)板計數(shù)。

將活化的酵母種子液以1.0×106 CFU/mL 的接種量接入150 mL YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測定其OD600值。以未接種的培養(yǎng)基為空白對照，以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制Mp 01生長曲線，每個樣品設(shè)置3個重復。

1.3.2 美極梅奇酵母菌液離心條件的確定

根據(jù)1.3.1確定的Mp 01生長曲線，在酵母減速生長末期及平衡期初期收集酵母菌體，通過考察不同離心力(2 184、2 852、3 610、4 457×g)及不同離心時間(3、5、10、15、20 min)對酵母收集率的影響，確定適宜離心轉(zhuǎn)速和離心時間。

1.3.3 酵母活菌計數(shù)方法

離心后收集菌泥，加入與離心菌液等體積的生理鹽水對菌體進行復溶。取離心前菌液及離心后菌泥用生理鹽水復溶后的菌液[17]，采用稀釋涂布法確定活菌數(shù)，存活率計算如公式(1)所示：

存活率

(1)

式中：N1，沉淀復溶液中的活菌數(shù)；N2，初始活菌數(shù)。

1.3.4 冷凍干燥方法

將離心后的菌泥放入無菌凍存管中，菌泥與保護劑按1∶2的體積比混合，放入-80 ℃冰箱預凍4 h。提前開啟凍干機，待冷阱溫度達到-40 ℃時，將處理好的MP 01立即放入凍干機，真空凍干24 h。采用稀釋涂布法計算冷凍干燥前后的活菌數(shù)[18]，如公式(2)所示：

存活率

(2)

式中：N3，凍干粉復溶后的活菌數(shù)；N4，初始活菌數(shù)。

1.3.5 不同保護劑對酵母存活率的影響

單因素試驗：選取海藻糖、蔗糖、乳糖、維生素C、谷氨酸鈉、甘氨酸、麥芽糖、脫脂乳粉、吐溫-80作為單一冷凍干燥保護劑，以上保護劑的濃度參照文獻報道[3,5,7-8]，分別設(shè)定質(zhì)量分數(shù)為3%、5%、7%、9%、11%，以存活率作為檢測指標初步篩選凍干存活率積極影響作用比較顯著的因素和水平，進行Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計。試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

1.3.6 Plackett-Burman試驗

根據(jù)1.3.5的試驗結(jié)果，確定保護劑種類，每個因素設(shè)置高、低2個水平，使用Design-Expert 8.0.6設(shè)計n=12的PB測試[19]，篩選對Mp 01存活率有顯著影響作用的保護劑成分。

1.3.7 最陡爬坡試驗

根據(jù)DU等[20]的方法，對Plackett-Burman試驗結(jié)果確定的顯著影響因素進行最陡爬坡試驗，分析對Mp 01凍干存活率具有顯著影響作用的因素，并進一步確定顯著影響因素的最佳水平范圍。

1.3.8 美極梅奇酵母凍干保護劑復合配方的優(yōu)化試驗及驗證

根據(jù)1.3.6的實驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken Design(BBD)響應面分析，確定Mp 01最優(yōu)凍干保護劑的配比[21]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合原理，主要采用Design-Expert 8.0.6中Plackett-Burman、RSM進行試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析及模型的建立，差異顯著性水平為0.01和0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 美極梅奇酵母生長曲線

由Mp 01的生長曲線可知(圖1)，在接入菌種后的0～6 h為酵母生長的遲滯期，9～18 h為酵母的對數(shù)生長期，21 h左右進入穩(wěn)定期(平衡期)，菌體量逐漸達到最大值，綜合考慮菌齡和菌體量，本試驗在發(fā)酵的第24 h進行菌體收集。

圖1 美極梅奇酵母生長曲線
Fig.1 Growth curve of M. pulcherrima

2.2 離心條件對美極梅奇酵母收集率的影響

將收集的Mp 01菌體在不同條件下進行離心，并計算Mp 01的收集率，結(jié)果如圖2所示。離心轉(zhuǎn)速和時間對菌體收集率有明顯影響，隨著轉(zhuǎn)速和時間的延長，離心收集率先增大再減小，在15 min時，收集率最高；20 min時降低，隨著時間的延長，離心力對酵母細胞的破壞影響增大，細胞死亡率增大，導致收集率下降。最終確定，2 852×g離心15 min，Mp 01的收集率最高為93.55%，為本試驗最佳離心條件。

圖2 美極梅奇酵母在不同離心力及 時間下的離心存活率
Fig.2 Survival rate of M. pulcherrima under different centrifugal force and time

2.3 單一保護劑對美極梅奇酵母凍干存活率的影響

綜合文獻報道結(jié)果，優(yōu)選9種物質(zhì)(表1)作為Mp 01冷凍干燥過程中的單一保護劑。由表1數(shù)據(jù)可知，9種單一保護劑對Mp 01具有不同保護作用。其中脫脂乳粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和乳糖等6種物質(zhì)作為單一保護劑時，Mp 01的存活率相對較高，存活率最高分別能達到64.9%，76.88%，77.3%，80.7%，70.92%，70.8%。因此，選擇以上6種保護劑進行顯著影響因素分析。

表1 不同保護劑種類及濃度對美極梅奇酵母凍干存活率的影響 單位：%

Table 1 Effect of different drying protective and concentration on the survival rate of yeast

2.4 Plackett-Burman試驗設(shè)計及顯著影響因素

根據(jù)1.3.6的方法，進行Plackett-Burman(PB)試驗因素與水平設(shè)計[19,22]，考查以上6種冷凍保護劑成分(脫脂乳粉、谷氨酸鈉、海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖)中，對Mp 01冷凍干燥過程中的存活率具有顯著影響作用的因素，PB設(shè)計結(jié)果見表2，試驗結(jié)果見表3，各因素效應分析見表4。

對試驗結(jié)果進行效應分析(表4)，發(fā)現(xiàn)本次PB試驗模型的P值為0.044 0，說明此模型在0.05水平上足以擬合試驗數(shù)據(jù)。表4中麥芽糖、蔗糖和海藻糖的效應值均為正，說明對Mp 01存活率有顯著正作用，

表2 Plackett-Burman設(shè)計因素與水平
Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman design

注：G、H、J、K、L為虛擬項(下同)

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果 單位：%

Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計各因素效應分析
Table 4 Effect analysis of Plackett-Burman experiments design

注：P<0.01 表示差異極顯著；0.01<P<0.05 表示差異顯著；P>0.05 表示差異不顯著

而其余因素作用效果不顯著(P>0.05)。因此，麥芽糖、蔗糖和海藻糖是對Mp 01冷凍過程中具有顯著保護作用的保護劑，需進一步確定這3種顯著因素的最佳添加水平和配比。

2.5 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果

本試驗利用最陡爬坡試驗，對顯著影響因素麥芽糖、蔗糖和海藻糖的濃度范圍和配比進行優(yōu)化，以對Mp 01凍干過程達到最好的保護作用。最陡爬坡試驗設(shè)計中，3個因素的變化方向的效應均為正效應(表4)，因此最陡爬坡試驗設(shè)計中以上3因素的水平均為正向變化，從低值往上增加。具體結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果 單位：%

Table 5 Designs and results of the steepest experiments

實驗結(jié)果表明，麥芽糖、蔗糖和海藻糖分別以13%、10%和14%(表5，試驗號5)進行配比時，對Mp 01的保護效果最好。因此，進一步將表5中的第5組試驗中的3因素及其水平確定為響應面優(yōu)化研究的試驗中心組合。

2.6 響應面法優(yōu)化美極梅奇酵母凍干復合保護劑配比

2.6.1 復合保護劑響應面試驗結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果(表5)，使用Design-Expert 8.0.6對麥芽糖、蔗糖和海藻糖進行三因素三水平響應面優(yōu)化設(shè)計。響應面具體設(shè)計方案和試驗結(jié)果如表6所示，方差分析如表7所示。

將表7中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合分析，獲得Mp 01的菌體存活率對麥芽糖、蔗糖和海藻糖的二元多項式回歸方程：

Y/%=93.35+3.71A+2.69B+2.00C-1.16AB-3.50AC-3.07BC-4.27A2-5.38B2-5.17C2

由表7可知，P<0.000 1，說明此模型在α=0.01的水平上回歸顯著；失擬項P值為0.058 9>0.05，

表6 美極梅奇酵母菌存活條件優(yōu)化Box-Benhnken 設(shè)計方案及結(jié)果 單位：%

Table 6 Design and results of Box-Benhnken experiments for survival conditions optimization of M. pulcherrima

表7 響應面試驗回歸方程方差分析
Table 7 Analysis of variance of regression equation

注：P<0.01表示差異極顯著

表明失擬項不顯著，由此可知該方程可真實反映Mp 01冷凍過程中存活率的實際情況。響應面試驗回歸方程的決定系數(shù)R2=0.990 3，表明該模型具有很好的相關(guān)性。修正后的決定系數(shù)表明該響應面試驗模型可以解釋97.79%的響應面值的變化。響應面的變異系數(shù)為1.09%，表明僅有1.09%的變異不能由該模型解釋。因此，可用該模型來預測不同保護劑組合對Mp 01存活率的影響，并且麥芽糖、蔗糖和海藻糖這3個因素對Mp 01菌體存活率影響作用都非常顯著。

2.6.2 冷凍保護劑最優(yōu)組合配方及驗證實驗

依據(jù)響應面優(yōu)化設(shè)計，通過對回歸模型進行數(shù)學分析，得到的Mp 01最優(yōu)凍干保護劑配方：麥芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L，在此條件下Mp 01存活率預測值為93.34%。將所得最優(yōu)保護劑配方應用于Mp 01的冷凍干燥，重復3次，Mp 01的平均存活率為92.78%，與預測值相差0.56%。以上結(jié)果說明，由響應面試驗設(shè)計得到的數(shù)學模型準確可靠，得到的最佳凍干保護劑組合方案可行，在實際操作中具有指導意義。

2.6.3 美極梅奇酵母發(fā)酵劑貯藏條件及穩(wěn)定性測定

對Mp 01凍干菌劑貯藏條件進行研究，實驗結(jié)果見表8，確定貯藏條件后，對其穩(wěn)定性進行持續(xù)觀察，結(jié)果見表9。

表8 美極梅奇酵母貯藏條件結(jié)果 單位：%

Table 8 Results of the storage conditions of M. pulcherrima

表9 美極梅奇酵母發(fā)酵劑貯藏穩(wěn)定性檢驗結(jié)果
Table 9 Result of M. pulcherrima starter storage stability test

通過對美極梅奇酵母菌劑貯藏條件的研究發(fā)現(xiàn)，凍干菌劑在-20 ℃條件下貯藏，其存活率遠高于室溫和4 ℃條件，對貯藏穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，在-20 ℃條件下保存4個月仍具有較高的存活率(89.85%)，說明在此條件下貯藏凍干菌劑具有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

酵母的代謝和生理特征存在種間和種內(nèi)差異，現(xiàn)階段并沒有普遍而有效的方法用于酵母凍干過程的保護。因此，對于不同的酵母，有必要開展針對性的凍干工藝，并優(yōu)化最佳保護劑的配方，以促進其商業(yè)生產(chǎn)和廣泛應用。本研究前期篩選出的美極梅奇酵母Mp 01具有纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶等多種水解酶活性，有利于提高水果果皮花色素苷及果皮中品種香氣成分的釋放，對果酒釀造過程中果酒的澄清及增香具有非常重要的影響作用。因此本研究開展了Mp 01冷凍干燥保護劑的優(yōu)化研究，以期為該酵母的廣泛應用及Mp商業(yè)菌劑的制備提供研究基礎(chǔ)和方法學參考。首先通過評估9種單一保護劑對Mp 01冷凍干燥過程的保護作用，發(fā)現(xiàn)脫脂乳粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和乳糖等6種保護劑對Mp 01具有較好保護作用，進一步通過Plackett-Burman試驗法，發(fā)現(xiàn)麥芽糖、蔗糖和海藻糖對Mp 01的保護作用最為顯著，最后通過最陡爬坡試驗和響應面法，確定了Mp 01冷凍干燥復合保護劑配方(麥芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L)，結(jié)果表明，Mp 01冷凍干燥后的平均存活率達到92.78%，比單一保護劑最高存活率提高了16%左右。

已有研究發(fā)現(xiàn)，糖醇類物質(zhì)是酵母冷凍干燥過程中的有效保護劑[4]，本研究也驗證了這一結(jié)論。在本研究中，對Mp 01具有顯著保護作用的保護劑均為糖醇類。對二糖、多元醇、單糖、脫脂乳和其他有機分子提高微生物的穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，干燥過程中碳水化合物通過形成玻璃態(tài)來提高細胞的穩(wěn)定性[23]。例如：海藻糖由于玻璃態(tài)的形成，可以置換水與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)形成的氫鍵，從而穩(wěn)定了微生物的細胞膜，減輕冷凍干燥對細胞的損傷[3]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)蔗糖是影響Mp 01凍干過程存活率的顯著影響因素之一，這與CARVALHO等[24]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)不能代謝的糖比代謝的糖更有效。N’GUESSAN等[25]也有類似的研究結(jié)果，在生產(chǎn)用于啤酒釀造的酵母發(fā)酵劑時發(fā)現(xiàn)，蔗糖是凍干過程中最好的保護劑。因此，結(jié)合本研究結(jié)果以及以上分析表明，海藻糖和蔗糖很有可能是非釀酒酵母尤其是Mp通用的效果良好的冷凍保護劑，后續(xù)需要開展更廣泛和深入的研究，已驗證以上推測。

一般來說，單一保護劑的作用是有限的，存在各自的缺點，但這些缺點可通過其他保護劑來彌補[5]，因此，復合保護劑的研究和開發(fā)，對于提高酵母凍干菌劑的穩(wěn)定性和活性尤為重要。由于菌種之間存在種間和種內(nèi)的差異性，同時不同類型的保護劑對不同種類細胞的存活率的影響不同，所以冷凍干燥中保護劑及其配方需要根據(jù)菌種進行特定篩選、優(yōu)化和改善。目前，有關(guān)Mp 01貯存期間的存活率以及該菌株的存活動力學及其在果酒釀造中的應用評價試驗正在進行中，使用優(yōu)化后的復合保護劑凍干的Mp 01，-20 ℃保藏30 d后，存活率為91.85%，保留了原存活率的99.51%，貯藏4個月后，仍具有較高的存活率(89.85%)，表現(xiàn)出較好的貯藏穩(wěn)定性，說明此復合保護劑對Mp 01的低溫貯藏具有很好的保護作用。此外，該復合保護劑是否適用于其他Mp、釀酒酵母、其他非釀酒酵母及釀酒酵母和Mp混菌發(fā)酵菌的開發(fā)，需要進一步的研究和驗證。