蘑菇醬油的細(xì)菌群落及揮發(fā)性風(fēng)味特征

傳統(tǒng)醬油以大豆或豆粕為底物在米曲霉的作用下經(jīng)制曲和鹽水發(fā)酵兩個(gè)階段自然發(fā)酵而成。但發(fā)酵底物局限性限制了醬油品質(zhì)的提升。近年來，作為氮源或碳源的酵母抽提物、玉米漿、植物莖葉以及無機(jī)鹽通常被添加到發(fā)酵的底物中以提高種曲和自然發(fā)酵菌群的活性，達(dá)到改善醬油發(fā)酵微生態(tài)并促進(jìn)特征風(fēng)味形成的目的[1]。而蘑菇本身是一種富含氨基酸、多糖、碳水化合物、粗纖維、核苷酸、維生素、脂肪酸和酰胺類物質(zhì)的保健食材，將其應(yīng)用到醬油的發(fā)酵中可以提高醬油的品質(zhì)并滿足消費(fèi)者的健康需求。之前研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇可以促進(jìn)醬油中的優(yōu)勢菌群從Stenotrophomonas向Bacillus轉(zhuǎn)換，并且酯類、醇類和亞油酸類香氣成分被上調(diào)[2]。杏鮑菇醬油以杏鮑菇∶面粉為5∶3的質(zhì)量比例發(fā)酵時(shí)，醬油顏色紅亮，并且菇香濃郁[3]。但不同種類蘑菇醬油的風(fēng)味特征和關(guān)鍵香氣成分的代謝菌群溯源未被探究。

醬油發(fā)酵時(shí)菌群微生態(tài)的特點(diǎn)將直接影響醬油風(fēng)味的產(chǎn)生。Bacillus通常具有淀粉酶、蛋白酶和L-谷氨酰胺酶基因，這可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵底物向風(fēng)味組分的轉(zhuǎn)變。Bacillus subtilis是醬油中4-乙基愈創(chuàng)木酚(辛香、香莢蘭香)和麥芽酚(焦奶油香)的主要貢獻(xiàn)者[4]。Bacillus velezensis則有助于3-甲基丁醛(蘋果香)的生成[5]。此外，Staphylococcus是驅(qū)動(dòng)醬油發(fā)酵的優(yōu)勢菌屬之一，其具有產(chǎn)生L-谷氨酰胺酶和2-甲基丙醛(甜香)的能力[6]。同樣的，乳酸菌也是醬油發(fā)酵中的核心菌群。Weissella和Pediococcus acidilactici與醬油乳酸和乙酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生密切相關(guān)；Lactobacillus plantarum可以提升醬油酮類和酚類物質(zhì)的含量；Tetragenococcus halophilus則是醛類和酸類風(fēng)味的優(yōu)質(zhì)貢獻(xiàn)者[7]。因此，對(duì)蘑菇醬油發(fā)酵的微生態(tài)進(jìn)行表征有利于風(fēng)味組分的溯源和特征風(fēng)味醬油的開發(fā)。

該研究首先以宏觀的微生物多樣性分析和微觀的共發(fā)生模型探討了蘑菇醬油發(fā)酵的微生態(tài)特點(diǎn)，并挖掘了核心發(fā)酵菌群。隨后以GC-MS技術(shù)表征了各種蘑菇醬油的風(fēng)味特征。并且將核心發(fā)酵菌群和特征香氣組分進(jìn)行了雙因素正交偏最小二乘法(the two way orthogonal partial least squares, O2PLS)建模以探究二者的相關(guān)性。該研究為醬油的改進(jìn)和新型蘑菇醬油的商品化提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

大豆、炒小麥粉，湖北安琪酵母股份有限公司；猴頭菇、滑子菇、草菇、雙孢菇、杏鮑菇、姬松茸、雞腿菇、茶樹菇、香菇，哈爾濱北大荒商貿(mào)集團(tuán)控股公司；米曲霉As3.042，天津科技大學(xué)菌種室；16S rRNA的V3～V4引物、TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit，北京諾禾致源科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，貴州天根生物有限公司；C6～C33正構(gòu)烷烴混合物標(biāo)準(zhǔn)品(≥97%)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina NovaSeq 6000高通量測序儀，上海鯨舟基因科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7890AGC氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司；Rtx-5色譜柱，上海圣賓儀器科技有限公司；手動(dòng)頂空固相微萃取進(jìn)樣器、固定搭載裝置及固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR)，美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘑菇醬油的發(fā)酵

將浸泡6 h的120 g大豆與120 g炒小麥粉和26.7 g鮮蘑菇粉混勻浸潤，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min。冷卻至35 ℃后，接入質(zhì)量比0.3%的種曲，混勻后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。大曲出現(xiàn)白色菌絲時(shí)進(jìn)行第一次翻曲，表面呈淡黃色時(shí)第二次翻曲，培養(yǎng)至大曲黃綠色時(shí)收曲。向成熟的大曲拌入曲料質(zhì)量2倍的180 g/L的鹽水，裝入發(fā)酵罐進(jìn)行升溫式開放發(fā)酵。初始發(fā)酵溫度16 ℃，每天升高1 ℃，升溫至30 ℃時(shí)進(jìn)入恒溫發(fā)酵階段，發(fā)酵周期為180 d，并每天進(jìn)行攪拌[2]。以傳統(tǒng)大豆醬油作為對(duì)照組，將浸泡6 h的140 g大豆與120 g炒小麥粉攪拌均勻，發(fā)酵流程同實(shí)驗(yàn)組。從發(fā)酵起始每隔30 d取樣1次，并對(duì)所有發(fā)酵階段樣品混樣處理，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組每組樣品取3個(gè)平行備用。

1.3.2 蘑菇的營養(yǎng)成分測定

水分測定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；總灰分測定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》；粗蛋白測定參照GB 5009.5—2016 《食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪測定參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；粗纖維測定參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》；氨基酸測定參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。

1.3.3 細(xì)菌群落高通量測序

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取發(fā)酵醬油細(xì)菌DNA，以質(zhì)控和稀釋后的總的醬油細(xì)菌菌群DNA為模板(1 ng/μL)，擴(kuò)增16S rRNA的V3～V4區(qū)域。其引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×buffer 5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷1 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，TaqDNA聚合酶(50 U/μL)0.5 μL，DNA模板100 ng，超純水40 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃，90 s；72 ℃，10 min。將PCR產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行混樣和純化?；厥盏漠a(chǎn)物以TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒構(gòu)建文庫，并使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

將下機(jī)數(shù)據(jù)截去標(biāo)記條帶和引物后，對(duì)得到的reads進(jìn)行拼接。將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和質(zhì)控得到最終有效序列。以97%的一致性將有效序列聚類成可操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)，并進(jìn)行物種注釋。以MUSCLE軟件(版本3.8.31)進(jìn)行多序列比對(duì)并確立系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。將均一化的樣本數(shù)據(jù)以Qiime軟件(版本1.9.1)計(jì)算香農(nóng)和Chao1指數(shù)，并計(jì)算weight Unifrac距離和構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹。主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis, PCoA)使用R(版本3.6.3)軟件的WGCNA、stats和ggplot2軟件包。PCoA圖中3個(gè)相同的點(diǎn)代表3個(gè)平行，PC1和PC2分別是2個(gè)解釋度最高的主成分，樣品間的距離表示細(xì)菌群落的差異。線性判別分析得分設(shè)置為3.5，以篩選出樣品組的生物標(biāo)記選出相對(duì)豐度大于0.05 %的菌屬為節(jié)點(diǎn)，計(jì)算Spearman相關(guān)性以過濾掉關(guān)聯(lián)性較弱的節(jié)點(diǎn)(P>0.7，P<0.01)。以Gephi-0.9.2軟件重構(gòu)生態(tài)共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)，其中重構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)為關(guān)聯(lián)性較高的菌屬，連接節(jié)點(diǎn)的邊對(duì)應(yīng)節(jié)點(diǎn)之間的相關(guān)性，隨后計(jì)算了網(wǎng)絡(luò)的聚類系數(shù)。

1.3.5 揮發(fā)性成分檢測

固相微萃取條件：選用50/30 μm DVB/CAR萃取頭，在20 mL頂空瓶中加入4 mL發(fā)酵樣品和1.5 g NaCl，60 ℃預(yù)熱20 min，插入萃取頭，萃取吸附20 min，GC解吸5 min(250 ℃)。

色譜條件：色譜柱為Rtx-5色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序：35 ℃保持4 min，以5 ℃/min的速度升溫至150 ℃，恒溫保持4 min，然后以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持5 min。載氣He，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500 u。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用保留指數(shù)(retention index, RI)，并結(jié)合NIST14譜庫檢索進(jìn)行定性分析。將C6～C30正構(gòu)烷烴混合物單獨(dú)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，升溫程序和GC-MS檢測條件一致。保留指數(shù)計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：RI，保留指數(shù)；n，未知物流出前正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；t′(n)，具有n個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時(shí)間，min；t′(n+1)，具有n+1個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時(shí)間，min；t′(i)，待測組分的調(diào)整保留時(shí)間，min。隨后以峰面積比值法對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定量[8]。

顯著性分析由SPSS 25執(zhí)行。其中，香農(nóng)和Chao1指數(shù)的顯著性分析由單因素ANOVA檢驗(yàn)執(zhí)行，標(biāo)注的不同的字母代表顯著差異(P<0.05)。揮發(fā)性成分的顯著性分析由Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)執(zhí)行，并以FDR進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正。風(fēng)味代謝物與微生物組之間的相關(guān)性由SIMCA-14.1構(gòu)建的O2PLS模型表征。同時(shí)，以R軟件(版本 3.6.3)計(jì)算了風(fēng)味成分和核心菌群的Spearman相關(guān)性系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘑菇的主要營養(yǎng)物質(zhì)

從表1可知，每種新鮮蘑菇的含水量都在90 g/100 g以上；總灰分含量最低的是雙孢菇(8.12 g/100 g)，最高的是杏鮑菇(14.25 g/100 g)。新鮮蘑菇中蛋白質(zhì)的含量占約3%，雙孢菇含有最高量的粗蛋白，猴頭菇和草菇其次，在植物中屬于蛋白質(zhì)含量比較高的食品。蘑菇作為低脂肪食品，其粗脂肪含量僅占1%左右。蘑菇中供能的單糖、雙糖、淀粉類糖含量少，但含有比例較高的功能性多糖和膳食纖維。多糖是蘑菇的重要功能性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抑菌等生理活性。猴頭菇較高的多糖含量(4.21 g/100 g)可能更加利于發(fā)酵益生菌的利用。

表1 蘑菇中的營養(yǎng)成分 單位：g/100 g

Table 1 Nutrients in mushrooms

注：以可食用部分計(jì)(下同)

氨基酸是食物風(fēng)味的主要來源，蘑菇蛋白質(zhì)含量是植物性食品中比較高的。根據(jù)表2可以看出，呈鮮味的氨基酸占比在總氨基酸的30%以上。各個(gè)呈味氨基酸濃度均大于其對(duì)應(yīng)閾值，對(duì)醬油鮮味有較高貢獻(xiàn)。草菇和猴頭菇鮮味氨基酸占比最高，豐富的鮮味氨基酸是醬油發(fā)酵不可或缺的物質(zhì)。

表2 蘑菇中呈鮮味氨基酸的含量
Table 2 Content of umami amino acids in mushrooms

2.2 蘑菇醬油的宏觀微生態(tài)

分別以香農(nóng)和Chao1指數(shù)表征蘑菇醬油的多樣性和豐富度(圖1-a)。與大豆醬油相比，猴頭菇醬油中細(xì)菌的多樣性和豐富度顯著降低(P<0.05)。因?yàn)楹镱^菇本身特有的cyathane型二萜類次級(jí)代謝產(chǎn)物，如猴頭菇素C和猴頭菇素P，具有強(qiáng)烈的抗菌活性[9]。與之相反的是，香菇醬油中細(xì)菌的多樣性和豐富度顯著高于對(duì)照(P<0.05)。香菇所攜帶的原始菌群，有助于有機(jī)質(zhì)的降解和菌絲的生長，這為其他細(xì)菌提供了營養(yǎng)活性物質(zhì)[10]。其他蘑菇醬油的多樣性和豐富度與大豆醬油相比都出現(xiàn)了一定的變化(P>0.05)。蘑菇的添加為醬油發(fā)酵提供了豐富的菌體蛋白和蘑菇多糖，這誘導(dǎo)蘑菇醬油和傳統(tǒng)大豆醬油的菌群出現(xiàn)偏移。

a-多樣性差異；b-組成差異
圖1 蘑菇醬油細(xì)菌的多樣性和組成差異
Fig.1 Diversity and composition difference of bacteria in mushroom soy sauce

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析驗(yàn)證了蘑菇醬油的菌群特點(diǎn)(圖1-b)。與多樣性和豐富度的分析結(jié)果一致，猴頭菇醬油的細(xì)菌群落是與其它醬油分離的?；诤镱^菇的抗菌性，可能形成了某一優(yōu)勢且單一的菌群，并主導(dǎo)了醬油的發(fā)酵。其次，草菇、茶樹菇和姬松茸醬油的發(fā)酵菌群各不相同，這是蘑菇醬油風(fēng)味多樣化的前提。而雞腿菇、杏鮑菇、雙孢菇和滑子菇醬油的細(xì)菌群落在主坐標(biāo)PC1(68.02%)上與大豆醬油是相似的，這些蘑菇對(duì)細(xì)菌群落的干預(yù)性較低。香菇雖然顯著提高了細(xì)菌的多樣性和豐富度，但香菇醬油的菌群結(jié)構(gòu)依舊與大豆醬油類似。這意味著香菇雖然促進(jìn)了菌群的繁殖，但這些菌群并不是醬油的核心發(fā)酵菌群。

2.3 蘑菇醬油的微觀系統(tǒng)型

如電子出版附件1所示，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria是蘑菇醬油的兩大主導(dǎo)菌門，這與傳統(tǒng)大豆醬油的檢測結(jié)果是一致的，蘑菇添加并不會(huì)破壞醬油菌群的系統(tǒng)型[11]?；庸?、雙孢菇和杏鮑菇對(duì)醬油菌群的改良作用并不明顯，它們和大豆醬油一樣都被Proteobacteria 占據(jù)了主導(dǎo)地位。Proteobacteria 被認(rèn)為是生物胺合成基因的主要攜帶者，這可能會(huì)降低醬油的品質(zhì)[12]。而這種現(xiàn)象在姬松茸、茶樹菇、香菇和雞腿菇醬油中得到了改善。這些醬油中出現(xiàn)了豐富的Euryarchaeota和Cyanobacteria。Euryarchaeota通常是具有嗜鹽和嗜酸特性的高抗逆細(xì)菌并且具有潛在的揮發(fā)性烷烴生產(chǎn)能力[13]。此外，Cyanobacteria和乳酸菌的協(xié)同發(fā)酵為姬松茸醬油提供了降血脂和抗肥胖的保健功能[14]。醬油發(fā)酵主要的菌屬Bacillus、Listeria、Lactobacillus、Lactococcus、Staphylococcus、Roseburia等，都屬于Firmicutes菌門，是醬油發(fā)酵的風(fēng)味細(xì)菌，即在醬油發(fā)酵過程中的次生細(xì)菌。乳酸菌可以分解代謝醬醪中的碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，降低醬醪的pH值，不僅能夠抑制致病菌的生長繁殖還可以為后期酵母菌生長創(chuàng)造有利環(huán)境。Staphylococcus是肉類發(fā)酵食品產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的主要風(fēng)味細(xì)菌。Bacillus產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶可以分解蛋白質(zhì)和淀粉類物質(zhì)。復(fù)雜化合物的分解是影響發(fā)酵食品的關(guān)鍵步驟。在系統(tǒng)型變化最顯著的草菇和猴頭菇醬油中，F(xiàn)irmicutes取代Proteobacteria成為了主導(dǎo)菌門，而Firmicutes的豐富性通常是高品質(zhì)發(fā)酵食品的必要條件[15]。

菌群共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)展示了各系統(tǒng)型聚類中菌群的協(xié)作方式(見電子出版附件1)。草菇和猴頭菇構(gòu)成的細(xì)菌菌群聚類Ⅰ由Stenotrophomonas 輔以Staphylococcus和Bacillus維系連通性。但屬于Proteobacteria的各個(gè)菌屬和Firmicutes的節(jié)點(diǎn)多為負(fù)相關(guān)，這表明草菇和猴頭菇醬油中的Firmicutes，特別是Staphylococcus和Bacillus對(duì)致病菌Stenotrophomonas具有抑制作用。這和Proteobacteria的動(dòng)態(tài)變化通常與Firmicutes呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論一致[16]。大豆醬油與杏鮑菇、雙孢菇、滑子菇醬油菌群構(gòu)成的系統(tǒng)型聚類Ⅱ的聚類系數(shù)最低(0.47)，遠(yuǎn)小于聚類Ⅰ(0.59)和聚類Ⅲ(0.86)。因此，聚類Ⅱ的菌屬協(xié)作性較弱。這導(dǎo)致菌群穩(wěn)態(tài)相對(duì)較差，并且醬油的發(fā)酵進(jìn)程易被外界環(huán)境改變，且醬油品質(zhì)可控性降低。姬松茸、茶樹菇、香菇和雞腿菇醬油中的優(yōu)勢菌屬Stenotrophomonas、Staphylococcus、Faecalibacterium和Bacillus在聚類Ⅲ的連通度并不高。核心發(fā)酵菌可能在這些醬油的發(fā)酵中單獨(dú)發(fā)揮作用，因而缺乏了對(duì)Stenotrophomonas和Staphylococcus中潛在致病菌的抑制作用。然而，聚類Ⅲ中多樣的非優(yōu)勢菌屬卻連通成了獨(dú)特的“小世界”形態(tài)[17]。這可能與醬油的特征風(fēng)味的形成有關(guān)。

2.4 蘑菇醬油的細(xì)菌菌群

核心的細(xì)菌發(fā)酵菌屬如圖2-a所示，除了猴頭菇、草菇和雞腿菇醬油，其他醬油都以Stenotrophomonas為主導(dǎo)菌屬。這與Stenotrophomonas在共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中受多重發(fā)酵菌群抑制的現(xiàn)象一致。Stenotrophomonas的β-半乳糖苷酶可以分解大豆和蘑菇產(chǎn)品中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而提高機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率[18]。但是，Stenotrophomonas的賴氨酸脫羧酶可將賴氨酸轉(zhuǎn)化為1,5-戊二胺，這可能會(huì)對(duì)醬油的感官評(píng)估和安全性產(chǎn)生負(fù)面影響。Staphylococcus是草菇和雞腿菇醬油的優(yōu)勢菌群也是滑子菇醬油的生物標(biāo)記之一。Staphylococcus分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖并產(chǎn)酸，是醬油發(fā)酵的主要驅(qū)動(dòng)者之一[19]。大多數(shù)Staphylococcus(Staphylococcus aureus除外)被認(rèn)為對(duì)人類無害，基于其高抗?jié)B透性，醬油發(fā)酵時(shí)鹽溶液的添加不會(huì)抑制Staphylococcus的活性[20]。此外，Staphylococcus可以產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，促進(jìn)醬油風(fēng)味的形成[20-21]。Bacillus主導(dǎo)了猴頭菇醬油的細(xì)菌群落。由于其對(duì)淀粉和蛋白質(zhì)的高效酶解作用，Bacillus被認(rèn)為是醬油發(fā)酵中必不可少的細(xì)菌群落[22]。Bacillus是淀粉酶，特別是α-淀粉酶的優(yōu)良生產(chǎn)者。通過水解淀粉分子鏈中的α-1,4-葡糖苷鍵，α-淀粉酶可以將淀粉轉(zhuǎn)化為短鏈糊精，麥芽糖和葡萄糖[23-24]。特別的，Macellibacteroides和Methanosaeta是香菇醬油的生物標(biāo)記，并且它們是聚類Ⅲ中“小世界”結(jié)構(gòu)的主要貢獻(xiàn)者(見電子出版附件1)。據(jù)報(bào)道，Macellibacteroides可以協(xié)作Arcobacter、Acinetobacter、Petrimonas和Clostrium起到促游離脂肪酸釋放的作用，這可能是“小世界”結(jié)構(gòu)的潛在功能。此外，Methanosaeta可能是香菇醬油中揮發(fā)性烷烴成分的主要貢獻(xiàn)者[25]。Sphingomonas是雙孢菇醬油菌群的生物標(biāo)記，其可以降解單環(huán)芳烴、聯(lián)苯、取代芳香化合物及多環(huán)芳香烴，并且苯甲酸可以通過Sphingomonas代謝生成乙醛和丙酮酸鹽，這增加了雙孢菇醬油的水果香氣。

a-核心菌屬；b-生物標(biāo)記
圖2 蘑菇醬油的核心菌屬和生物標(biāo)記
Fig.2 Core bacteria and biomarkers of mushroom soy sauce

2.5 蘑菇醬油的風(fēng)味組分

各種蘑菇醬油間濃度差異顯著的風(fēng)味成分如圖3所示。與大豆醬油相比，蘑菇醬油主要上調(diào)了酯類和醇類香氣組分。蘑菇醬油中的酯類物質(zhì)，如苯乙酸乙酯、油酸乙酯、α-戊基-γ-丁內(nèi)酯、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯和安息香酸乙酯普遍升高，因此蘑菇醬油具有更濃郁的果香和花香風(fēng)味。特別的，只有雙孢菇和杏鮑菇醬油檢測到了亞麻酸乙酯(酯香)。而豐富的亞油酸乙酯為茶樹菇提供了酯香的同時(shí)，也賦予茶樹菇醬油抗動(dòng)脈粥樣硬化的保健功能。而具有蠟香和奶油香氣的十六碳酸乙酯是雙孢菇和茶樹菇醬油的特征風(fēng)味成分。

圖3 蘑菇醬油的特征風(fēng)味成分
Fig.3 Characteristic flavor components of mushroom soy sauce

對(duì)于醇類香氣，2-甲基-1-丁醇、蘑菇醇和異丁醇是蘑菇醬油普遍上調(diào)的風(fēng)味物質(zhì)。而具有玫瑰花香的苯乙醇是蘑菇醬油上調(diào)最顯著的風(fēng)味成分，特別是在杏鮑菇醬油中。異戊醇具有蘋果和白蘭地的香氣，這是草菇醬油的特征香氣。2,3丁二醇和乙醇分別在滑子菇和香菇醬油中顯著提升，這為醬油增添了醇香。特別是與大豆醬油相比，乙醇在香菇醬油中提高了31.82倍。

此外，蘑菇的添加對(duì)酮、醛、酸和吡嗪類特征風(fēng)味物質(zhì)形成的干預(yù)性較小。蘑菇醬油對(duì)具有風(fēng)信子香氣的苯乙醛和焦糖味的異戊醛的生成具有普遍的促進(jìn)作用。有趣的是，添加蘑菇發(fā)酵將剝奪醬油中具有橙子香氣的D-檸檬烯成分，這可能是因?yàn)槲⑸锏陌l(fā)酵作用將烯烴類成分氧化成了酯類。

2.6 核心細(xì)菌菌群對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)

如電子出版附件2所示，O2PLS模型(R2=0.966，Q2=0.895)表征了核心細(xì)菌菌群和風(fēng)味成分之間的相互作用。模型預(yù)測結(jié)果與菌群的系統(tǒng)型聚類分析一致，蘑菇醬油在橫坐標(biāo)R2X[1]上出現(xiàn)了3種風(fēng)味醬油的聚類。而作為對(duì)照的傳統(tǒng)大豆醬油則位于O2PLS模型的中心，因此與蘑菇醬油相比，大豆醬油是缺乏風(fēng)味特點(diǎn)的。杏鮑菇、雙孢菇和滑子菇的風(fēng)味特點(diǎn)主要由酯類成分貢獻(xiàn)，包括9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、硬脂酸乙酯、安息香酸乙酯、α-戊基-γ-丁內(nèi)酯、鄰二甲苯酸二丁酯和9,12-十八碳二烯乙酯。而這些酯類被預(yù)測與醬油中生物標(biāo)記Roseburia 和Sphingomonas的代謝有關(guān)。茶樹菇和姬松茸醬油雖然有著和雞腿菇和香菇類醬油類似的菌群系統(tǒng)型，它們依舊被O2PLS模型的R2X[2]坐標(biāo)分開。茶樹菇和姬松茸的風(fēng)味成分主要與Vibrio、Cyanobacteria和Psychrilyobacter的代謝相關(guān)，而這些細(xì)菌主要來自于發(fā)酵的外界環(huán)境。因此，茶樹菇和姬松茸醬油形成的特征酸味成分2-甲基丁酸和異戊酸主要受環(huán)境因素的調(diào)控。相反，具有相同系統(tǒng)型的雞腿菇和香菇醬油則以包括棕櫚酸異丁酯、棕櫚酸異丙酯、辛酸乙酯和正己酸乙酯在內(nèi)的酯類香氣為主，因?yàn)?span id="7jvbvxv" class="emphasis_italic" style="font-style: italic;">Faecalibacterium對(duì)短鏈脂肪酸的消解具有促進(jìn)作用，并且是系統(tǒng)型聚類Ⅲ互作網(wǎng)絡(luò)的主要維系者。如電子出版附件1所示，Faecalibacterium通過與Lactobacillus、Enterococcus和Streptococcus等多種乳酸菌的直接或間接協(xié)作促進(jìn)了雞腿菇和香菇醬油酯類風(fēng)味成分的形成。與其他蘑菇相比，系統(tǒng)型Ⅰ中草菇和猴頭菇醬油的菌群與大豆醬油差異最顯著，這直接導(dǎo)致了草菇和猴頭菇醬油的獨(dú)特的風(fēng)味成分構(gòu)成。豐富的酯類、醇類、醛酮類和芳香雜環(huán)類成分共同構(gòu)成草菇和猴頭菇的風(fēng)味特征。這種現(xiàn)象一方面歸因于優(yōu)勢發(fā)酵菌Staphylococcus和Bacteroides的發(fā)酵驅(qū)動(dòng)作用，另一方面是因?yàn)榉莾?yōu)勢菌群Methanosaeta和Macellibacteroides通過與其他菌群的協(xié)同作用參與了發(fā)酵。

Spearman相關(guān)性系數(shù)(|Ρ| ≥ 0.7)被用于進(jìn)一步發(fā)掘菌群對(duì)風(fēng)味物質(zhì)形成的驅(qū)動(dòng)作用(電子出版附件2)。Staphylococcus主要促進(jìn)了酯類和醇類成分的形成。這與Staphylococcus可以促進(jìn)揮發(fā)性脂肪酸的生成并促進(jìn)其酯化反應(yīng)的進(jìn)行的結(jié)論一致[19-20]。Enterobacter主要與蘑菇醬油中酮類物質(zhì)的生成有關(guān)。但Enterobacter并非優(yōu)勢菌群，且協(xié)作性也不高，這限制了其作用的發(fā)揮，并導(dǎo)致酮類成分并沒有在蘑菇醬油中大幅度上調(diào)。Stenotrophomonas對(duì)幾種代表性的酯類、醛類、酸類和酮類呈負(fù)相關(guān)，但草菇和猴頭菇醬油中優(yōu)勢菌群Staphylococcus和Bacillus與其他非優(yōu)勢菌群共同參與了對(duì)Stenotrophomonas的抑制，因此醬油香氣成分的產(chǎn)生并未受影響。其他優(yōu)勢菌如Cyanobacteria、Bacillus、Psychrilyobacter和Bacteroides的主要貢獻(xiàn)也是針對(duì)于酯類的形成。特別的，Vibrio和Psychrilyobacter可能促進(jìn)了正癸醛和異丁醛的形成，這可以彌補(bǔ)蘑菇醬油中缺乏的橘皮的清甜氣味。

3 結(jié)論與討論

蘑菇醬油發(fā)酵的細(xì)菌群落區(qū)別于傳統(tǒng)大豆醬油，這導(dǎo)致蘑菇醬油的酯類和醇類風(fēng)味物質(zhì)更為濃郁。杏鮑菇、雙孢菇和滑子菇醬油的發(fā)酵細(xì)菌群落與大豆醬油最為接近，但作為生物標(biāo)記的Roseburia和Sphingomonas可以強(qiáng)化蘑菇醬油中9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、硬脂酸乙酯等特征酯類組分的產(chǎn)出。猴頭菇和草菇對(duì)醬油菌群的干預(yù)性最大，而發(fā)酵細(xì)菌的遷移是揮發(fā)性風(fēng)味組分多元化的前提。優(yōu)勢菌Staphylococcus和Bacteroides的發(fā)酵驅(qū)動(dòng)作用以及非優(yōu)勢菌群Methanosaeta和Macellibacteroides的協(xié)同發(fā)酵模塊造就了猴頭菇和草菇醬油中酯類、醇類、醛酮類和芳香雜環(huán)類成分的多元化。茶樹菇、姬松茸、雞腿菇和香菇醬油具有相近的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育型。發(fā)酵環(huán)境中的Vibrio、Cyanobacteria和Psychrilyobacter的代謝與茶樹菇和姬松茸醬油的特征酸味成分2-甲基丁酸和異戊酸密切相關(guān)。在雞腿菇和香菇醬油發(fā)酵中，Faecalibacterium通過與Lactobacillus、Enterococcus和Streptococcus等多種乳酸菌的協(xié)同發(fā)酵作用促進(jìn)了酯類特征風(fēng)味成分的形成。蘑菇醬油發(fā)酵時(shí)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育型和共發(fā)生特點(diǎn)調(diào)控了醬油的風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，但蘑菇并不會(huì)破壞傳統(tǒng)大豆醬油發(fā)酵的宏觀菌門Firmicutes和Proteobacteria的主導(dǎo)地位，這是在保證醬油品質(zhì)基礎(chǔ)上進(jìn)行特征香氣提升的必要條件。該研究為新型醬油的研發(fā)和蘑菇醬油的改進(jìn)奠定了基礎(chǔ)。