八種多酚與核桃蛋白相互作用的研究

核桃又名胡桃、羌桃，屬胡桃科胡桃屬植物，在我國(guó)有1 700年的栽種歷史。核桃仁味甘性平，具有健胃、補(bǔ)血、潤(rùn)肺、益腎和補(bǔ)腦等功效，其蛋白質(zhì)及不飽和脂肪酸含量豐富，谷氨酸和精氨酸的占比較高，是一種較優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源[1]。

多酚類(lèi)化合物是植物體內(nèi)復(fù)雜次生的多元酚結(jié)構(gòu)代謝物，因其具有抗氧化、抗炎、抑菌、降低心血管風(fēng)險(xiǎn)等作用[2]，常作為添加劑和功能性成分應(yīng)用于食品行業(yè)。在一些食品的加工過(guò)程中，多酚常與蛋白質(zhì)共存并發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)相互作用，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，進(jìn)而影響食品的感官、功能和營(yíng)養(yǎng)特性[2-3]。研究表明，多酚可在一定程度上降低面筋蛋白聚合物的尺寸和強(qiáng)度[4]；提高蛋白質(zhì)的溶解性、消化性、抗氧化性及界面性質(zhì)[5-7]；誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)改變[8-11]；影響蛋白質(zhì)的表面疏水性及水包油乳狀液的物理和氧化穩(wěn)定性等[12-13]。

目前，多酚與植物蛋白互作的研究主要以大豆蛋白、面筋蛋白為主，而核桃蛋白作為植物蛋白重要來(lái)源之一，卻鮮有相關(guān)研究報(bào)道。因此本研究分別采用8種常見(jiàn)的多酚(阿魏酸、白藜蘆醇、橙皮素、兒茶素、槲皮素、姜黃素、沒(méi)食子酸、楊梅素)與核桃蛋白制備復(fù)合物，研究多酚對(duì)其加工性質(zhì)和光譜特性的影響，探討核桃蛋白-多酚的互作機(jī)制，為多酚在核桃蛋白制品生產(chǎn)加工中的應(yīng)用起一定指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

核桃仁，云南省保山市隆陽(yáng)區(qū)；福林酚試劑，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白，上海伯奧生物科技有限公司；阿魏酸、白藜蘆醇、橙皮素、兒茶素、槲皮素、姜黃素、沒(méi)食子酸、楊梅素，上海源葉公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

ModulyoD真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Thermo公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；UV-1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科技儀器有限公司；Lumina熒光分光光度計(jì)，Thermo Scientific Coporation；F50型酶標(biāo)儀，Tecan；3K15高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；204F1差示量熱掃描儀，德國(guó)耐馳儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核桃蛋白的提取工藝

工藝流程為：

核桃仁→浸泡(5 mg/mL NaOH溶液，30 min)→清水漂洗→剝?nèi)ト势ぁ娓?55 ℃)→粉碎→石油醚脫脂→抽濾→濾渣烘干→粉碎→提取[料液比1∶25(g∶mL)，pH 9.0，攪拌1 h]→離心(5 500 r/min，10 min)→上清液→酸沉(pH 5.0，靜置12 h)→離心(5 500 r/min，10 min)→沉淀→蒸餾水洗至中性→凍干[14]。

1.3.2 多酚-核桃蛋白復(fù)合物的構(gòu)建

參考ALI[15]的方法并稍加改動(dòng)。分別將阿魏酸、白藜蘆醇、橙皮素、兒茶素、槲皮素、姜黃素、沒(méi)食子酸、楊梅素這8種多酚配制為10 μmol/mL的溶液，與3 mg/mL的核桃蛋白溶液混勻后，于37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，經(jīng)透析72 h后凍干為多酚-核桃蛋白復(fù)合物(polyphenol-walnut protein，PWP)。

1.3.3 紫外吸收光譜掃描

以pH 7.9磷酸鹽緩沖液將PWP配制為3 mg/mL溶液，設(shè)定狹縫寬度為2.0 nm，取樣間隔為1 nm，于195～450 nm掃描吸光度值，并以相同質(zhì)量濃度的核桃蛋白溶液作對(duì)照。

1.3.4 熒光光譜掃描

取10 μmol/mL的核桃蛋白樣液，分別與不同體積的阿魏酸溶液(10 μmol/mL)混勻，使其終濃度分別為0、0.01、0.02、0.04、0.08 μmol/mL。于激發(fā)波長(zhǎng)280，狹縫寬度4 nm，發(fā)射掃描波長(zhǎng)290～420 nm掃描其熒光光譜，并由Stern-Volmer方程計(jì)算猝滅速率常數(shù)(Kq)，猝滅常數(shù)(Ksv)，結(jié)合常數(shù)(Ka)以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)[16]。按相似的方法掃描其他7種多酚的熒光光譜，并按照公式(1)和公式(2)計(jì)算相應(yīng)的參數(shù)。

(1)

(2)

式中：Ka，結(jié)合常數(shù)；KSV，猝滅常數(shù)；n，結(jié)合位點(diǎn)；F0，加入猝滅劑前蛋白的熒光強(qiáng)度；F，加入猝滅劑后蛋白的熒光強(qiáng)度；[Q]，猝滅劑或者藥物濃度；Kq，速率常數(shù)；τ0，熒光分子的平均壽命，約為10-8s。

1.3.5 溶解度的測(cè)定

取15 mg PWP樣品分散于15 mL pH 7.9磷酸鹽緩沖液中，室溫下振蕩分散30 min，然后于5 500 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量。PWP溶解度的計(jì)算如公式(3)所示[14]:

溶解度

(3)

式中：m1為PWP樣品的總蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；m2為上清液的蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.3.6 持水性和持油性的測(cè)定

取100 mg PWP樣品(m)于20 mL離心管并稱重(m1)，加入4 mL水振蕩30 s使其分散均勻，于5 500 r/min 離心10 min后，傾去上清液，再次稱重(m2)，按公式(4)計(jì)算持水性(water holding capacity，WHC)。將上述水換為油，其余操作相同，按公式(5)計(jì)算吸油性(oil holding capacity，OHC)[14]:

(4)

(5)

1.3.7 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

將PWP配制為3 mg/mL的磷酸緩沖液，取25 mL于12 000 r/min高速分散1 min。記錄分散停止時(shí)的體積(V0)和停止后30 min的體積(V30)，起泡性(foaming capacity，F(xiàn)C)和泡沫穩(wěn)定性(foaming stability，F(xiàn)S)分別按公式(6)和(7)計(jì)算[17]:

(6)

(7)

式中：V0為均質(zhì)停止時(shí)的泡沫體積，mL；V30為均質(zhì)停止30 min時(shí)的泡沫體積，mL。

1.3.8 差示掃描量熱的測(cè)定

采用差示掃描量熱法測(cè)定PWP的變性溫度，以空鋁盒作為空白對(duì)照，掃描范圍為25～125 ℃，掃描速率為10 ℃/min。以樣品吸熱或放熱的速率(單位樣品mJ/s)為縱坐標(biāo)，以溫度為橫坐標(biāo)作圖。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件(版本22.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，P<0.05為具顯著性差異，并使用Origin 2018軟件作圖。使用R軟件(版本4.03)進(jìn)行聚類(lèi)相關(guān)性熱圖分析和主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白-多酚互作的紫外-可見(jiàn)光譜分析

紫外吸收光譜280 nm附近的吸收峰是大多數(shù)蛋白的共性，這是由于色氨酸和酪氨酸殘基對(duì)光的吸收。8種多酚與核桃蛋白復(fù)合后的紫外吸收光譜如圖1所示，核桃蛋白與多酚復(fù)合后的紫外吸收光譜的峰形變寬，280 nm附近的吸光度值增大，且最大吸收峰位略微紅移，表明發(fā)色基團(tuán)所處環(huán)境由極性向非極性變化，核桃蛋白與多酚形成了新的復(fù)合物。由于多酚與蛋白之間的相互作用，導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)附近的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境發(fā)生了變化[18]，并使結(jié)合位點(diǎn)暴露在一個(gè)更加疏水的微環(huán)境中。橙皮素、楊梅素及槲皮素與核桃蛋白復(fù)合后，在330 nm附近還出現(xiàn)了一個(gè)的吸收峰，可能是因多酚氧化形成的。這與高瑾等[19]的研究結(jié)果類(lèi)似，沒(méi)食子酸等多酚與玉米醇溶蛋白復(fù)合后，其特征吸收峰增大，且最大峰位發(fā)生遷移。

a-阿魏酸；b-白藜蘆醇；c-橙皮素；d-兒茶素；e-槲皮素；f-姜黃素；g-沒(méi)食子酸；h-楊梅素
圖1 核桃蛋白與8種多酚互作的紫外-可見(jiàn)光譜
Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of interaction between walnut protein and eight polyphenols

2.2 核桃蛋白與8種多酚互作的熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基可發(fā)射熒光[20]。核桃蛋白與8種多酚互作的熒光光譜如圖2所示，隨著多酚濃度的增加，核桃蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地被猝滅，說(shuō)明多酚與核桃蛋白的結(jié)合過(guò)程中，發(fā)射熒光的色氨酸殘基、酪氨酸殘基和苯丙氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致其內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，且猝滅效果因多酚種類(lèi)的不同而顯現(xiàn)出差異，當(dāng)槲皮素濃度為0.08 μmol/mL時(shí)，幾乎可完全將核桃蛋白的內(nèi)源熒光猝滅，說(shuō)明槲皮素與核桃蛋白互作時(shí)，更接近于位于蛋白疏水空腔內(nèi)自發(fā)熒光的氨基酸殘基[21]。

在熒光猝滅過(guò)程中，阿魏酸、橙皮素與核桃蛋白復(fù)合發(fā)生了紅移現(xiàn)象，其他多酚的復(fù)合則發(fā)生輕微的藍(lán)移現(xiàn)象，由此推測(cè)這8種多酚對(duì)核桃蛋白的熒光猝滅可能是靜態(tài)猝滅引起的[21]。通過(guò)Stern-Volmer方程計(jì)算猝滅速率常數(shù)(Kq)，猝滅常數(shù)(Ksv)，結(jié)合常數(shù)(Ka)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n),如表1所示，多酚與核桃蛋白的猝滅速率常數(shù)Kq大于各類(lèi)熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的最大猝滅速率常數(shù)[約為2.0×1010L/(mol·s)]，說(shuō)明8種多酚對(duì)核桃蛋白的熒光猝滅作用是以靜態(tài)猝滅為主。楊梅素、槲皮素、姜黃素的Ka值較大，說(shuō)明它們與核桃蛋白之間可形成較穩(wěn)定的復(fù)合物。這與JIA等[22]的研究結(jié)果相似，綠原酸、阿魏酸等多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合后，可使熒光光譜不同程度地猝滅，并出現(xiàn)光譜的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象。

a-阿魏酸；b-白藜蘆醇；c-橙皮素；d-兒茶素；e-槲皮素；f-姜黃素；g-沒(méi)食子酸；h-楊梅素
圖2 核桃蛋白與8種多酚互作的熒光光譜
Fig.2 Fluorescence spectrum of interaction between walnut protein and eight polyphenols

在NCBI PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中輸入化合物名稱，查詢得楊梅素、槲皮素、姜黃素、橙皮素、阿魏酸、沒(méi)食子酸、白藜蘆醇、兒茶素的疏水參數(shù)計(jì)算參考值分別為1.2、1.5、3.2、2.4、1.5、0.7、3.1、0.4，對(duì)應(yīng)的氫鍵供受體數(shù)依次為6/8、5/7、3/6、2/6、5/7、2/4、4/5、5/6。由此可判斷核桃蛋白與8種多酚間的相互作用是以氫鍵為主，疏水相互作用為輔，與HASLAM等[23]提出多酚-蛋白質(zhì)相互作用的“多點(diǎn)疏水-氫鍵結(jié)合”理論較為契合。

2.3 多酚對(duì)核桃蛋白溶解度的影響

8種多酚對(duì)核桃蛋白溶解度的影響如圖3所示，核桃蛋白和8種多酚結(jié)合后溶解性均顯著降低(P<0.05)，其中槲皮素降幅最大。可能是核桃蛋白側(cè)鏈上的羥基、氨基和羧基可與多酚形成氫鍵和疏水相互作用，屏蔽了氨基酸殘基所帶電荷，從而影響核桃蛋白的溶解性。此外，堿性條件下多酚易被氧化，生成醌類(lèi)或半醌類(lèi)物質(zhì)，其極易與核桃蛋白的親核基團(tuán)(如游離氨基和巰基)共價(jià)結(jié)合，引起蛋白交聯(lián)，并減少其親水官能團(tuán)與水的接觸面積，進(jìn)一步降低核桃蛋白的溶解性。這與代世成等[24]的研究結(jié)果相似，兒茶素可與大豆蛋白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致溶解度的下降。

表1 PWP的熒光猝滅速率常數(shù)(Kq)，猝滅常數(shù)(Ksv)， 結(jié)合常數(shù)(Ka)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)
Table 1 Quenching rate constant (Kq), quenching constant (KSV), binding constant (Ka) and number of binding sites (n) of PWP

圖3 八種多酚對(duì)核桃蛋白溶解度的影響
Fig.3 Effect of eight polyphenols on solubility of walnut protein
注：WP-核桃蛋白；FA-WP-阿魏酸-核桃蛋白； R-WP-白藜蘆醇-核桃蛋白；H-WP-橙皮素-核桃蛋白； CA-WP-兒茶素-核桃蛋白；Q-WP-槲皮素-核桃蛋白； CU-WP-姜黃素-核桃蛋白；GA-WP-沒(méi)食子酸-核桃蛋白； M-WP-楊梅素-核桃蛋白；柱狀圖上不同小寫(xiě)英文字母表示 差異顯著，P<0.05(下圖同)

2.4 多酚對(duì)核桃蛋白持水性的影響

如圖4所示，核桃蛋白與8種多酚復(fù)合后持水性顯著降低，其中阿魏酸的降幅最大。核桃蛋白可與多酚通過(guò)分子間交聯(lián)形成不溶性物質(zhì)[7]，削弱蛋白質(zhì)與水的相互作用，不利于水分的保持，導(dǎo)致持水性的降低，而蛋白質(zhì)的持水能力與其結(jié)合水的能力成正比，因此與2.3中溶解度的結(jié)果相符合，與大豆蛋白-多酚復(fù)合物和乳清蛋白-多酚復(fù)合物的持水性結(jié)果相似[10,16]。

圖4 八種多酚對(duì)核桃蛋白持水性的影響
Fig.4 Effect of eight polyphenols on WHC of walnut protein

2.5 多酚對(duì)核桃蛋白吸油性的影響

多酚對(duì)核桃蛋白吸油性的影響如圖5所示，兒茶素、橙皮素和槲皮素可顯著增加核桃蛋白的吸油性，而其他5種多酚對(duì)核桃蛋白的吸油性影響不大?？赡苁且?yàn)槎喾右詺滏I，疏水等相互作用與核桃蛋白復(fù)合，其中兒茶素、橙皮素和槲皮素可使核桃蛋白的構(gòu)象發(fā)生較大變化，部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，分子間孔隙率提高，導(dǎo)致吸油性的增強(qiáng)[7]，這與岳鑫[10]的研究中一定濃度紅松種鱗多酚可提高乳清蛋白吸油性的結(jié)果類(lèi)似。

圖5 八種多酚對(duì)核桃蛋白吸油性的影響
Fig.5 Effect of eight polyphenols on OHC of walnut protein

2.6 多酚對(duì)核桃蛋白起泡性能的影響

多酚對(duì)核桃蛋白泡沫性和泡沫穩(wěn)定性的影響如圖6所示，除橙皮素、姜黃素和阿魏酸外，大部分多酚對(duì)核桃蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性有提高作用，其中兒茶素和沒(méi)食子酸顯著提高了核桃蛋白的起泡性能。蛋白質(zhì)的起泡性取決于其分子柔性大小，多酚中的羥基和疏水基可通過(guò)非共價(jià)鍵和核桃蛋白結(jié)合，形成更厚的多層蛋白吸附膜，使其泡沫性增加[6]。與曹艷蕓[6]、覃思等[25]的研究結(jié)果相似，多酚可在一定程度上提高乳清蛋白、大豆蛋白的起泡性能。而核桃蛋白與橙皮素、姜黃素和阿魏酸復(fù)合后起泡穩(wěn)定性的降低，可能是因?yàn)榕菽€(wěn)定性取決于其形成黏膜的剛性和彈性，在這些多酚的作用下，核桃蛋白形成的泡沫表面強(qiáng)度和剛性較強(qiáng)，泡沫更易破裂，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

圖6 八種多酚對(duì)核桃蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響
Fig.6 Effects of eight polyphenols on FA and FS of walnut protein
注：同一顏色柱狀圖上不同小寫(xiě)英文字母表示差異顯著(P<0.05)

2.7 多酚對(duì)核桃蛋白變性溫度的影響

核桃蛋白與8種多酚復(fù)合后的熱學(xué)特性如表2所示。核桃蛋白與8種多酚復(fù)合后，初始變性溫度、最大變性溫度和變性焓全部提高，其中白藜蘆醇-核桃蛋白復(fù)合物的最大變性溫度為103.24 ℃，增幅最大。其次為楊梅素、兒茶素、槲皮素和橙皮素。說(shuō)明核桃蛋白與8種多酚復(fù)合后，熱穩(wěn)定性得以提高?？赡苁且?yàn)槎喾优c核桃蛋白形成的非共價(jià)鍵和其他作用力使核桃蛋白對(duì)熱更穩(wěn)定，表現(xiàn)為變性溫度升高。這與乳蛋白-多酚復(fù)合物的熱穩(wěn)定性結(jié)果相一致[26]。

表2 PWP的熱學(xué)特性
Table 2 Thermal characteristic of PWP conjugates

2.8 相關(guān)性分析和主成分分析

對(duì)各PWP的加工性質(zhì)和熱性能進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析和PCA。相關(guān)性熱圖中聚類(lèi)距離越近和相關(guān)性系數(shù)越高，說(shuō)明樣本之間較為接近。另外各組樣本分布在不同維度空間的不同區(qū)域，同組的樣品在空間分布比較集中，因此可以采用PCA從不同維度展現(xiàn)樣品間的關(guān)系。PCA圖中樣本距離越近，說(shuō)明樣本越相似。如圖7所示，兒茶素-核桃蛋白復(fù)合物與核桃蛋白的聚類(lèi)距離最近、相關(guān)性系數(shù)最高、PCA圖中的距離也最近，說(shuō)明兒茶素-核桃蛋白復(fù)合物的性質(zhì)與核桃蛋白較為接近。由表1可知，兒茶素與核桃蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka值較小，也說(shuō)明其與核桃蛋白之間形成的復(fù)合物相對(duì)較不穩(wěn)定，導(dǎo)致對(duì)核桃蛋白性質(zhì)影響較小。另外，其他多酚與核桃蛋白、兒茶素-核桃蛋白復(fù)合物的聚類(lèi)距離較遠(yuǎn)、相關(guān)性系數(shù)也較低，且在PCA圖上與兩者明顯分開(kāi)，且距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明其他復(fù)合物的加工性質(zhì)和熱性能與核桃蛋白和兒茶素-核桃蛋白復(fù)合物可明顯區(qū)分，其中阿魏酸、沒(méi)食子酸、楊梅素、槲皮素對(duì)核桃蛋白的作用較為相近。姜黃素、橙皮素、楊梅素與核桃蛋白的相關(guān)性系數(shù)最低，PCA圖距離也較遠(yuǎn)，說(shuō)明這3個(gè)多酚對(duì)核桃蛋白的加工性質(zhì)和熱性能影響較大。

a-相關(guān)性熱圖；b-PCA圖
圖7 PWP的相關(guān)性分析圖和PCA圖
Fig.7 The correlation heatmap and PCA of PWP complexes

3 結(jié)論

阿魏酸等8種多酚與核桃蛋白形成了復(fù)合物，其對(duì)核桃蛋白的熒光猝滅作用是以靜態(tài)猝滅為主，主要作用力是以氫鍵為主，疏水相互作用為輔。8種多酚的加入均降低了核桃蛋白的溶解性和持水性；一些多酚的復(fù)合可增強(qiáng)核桃蛋白的吸油性，而大部分多酚可提高核桃蛋白的起泡性能和熱穩(wěn)定性?？傮w來(lái)看，姜黃素、橙皮素、楊梅素對(duì)核桃蛋白的加工性質(zhì)和熱性能影響較大，而兒茶素影響較小。研究通過(guò)分析8種多酚對(duì)核桃蛋白性質(zhì)的影響，可為多酚-植物蛋白的互作機(jī)制研究提供一些參考，對(duì)多酚在蛋白制品中的應(yīng)用具有一定意義。