集成納米增強基底的微流控SERS芯片及其致病菌檢測

將納米金屬溶膠通過外部注入的方式引入微流控芯片，使其與待測物進行有效混合，進而實現(xiàn)SERS光譜檢測。這種外部注入模式操作簡單方便，但是其靈敏度和重復性很大程度上依賴于被分析對象和金屬納米粒子間的有效接觸和混合。按照有無外界能量驅(qū)動的方式，芯片微通道中的混合過程可分為被動混合和主動混合兩種。

被動混合式芯片通過合理設計流體通道的內(nèi)部結構和幾何特性，改變流體的流動方式，增大混合面積來提高混合效率，具有操作簡單靈活的特性。Lee等^［32］研制的鋸齒形聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道，如圖1（a），可用于高效混合孔雀石綠（MG）和Ag NPs，基于SERS對水中MG進行檢測的檢出限低至12×10^-12 mg/L。Yea等^［33］在含有類似鱷魚齒形的PDMS微流體通道內(nèi)，使用SERS光譜技術對水體污染物中的氰化物進行檢測，檢測靈敏度達到0.5×10^-4 mg/L水平，如圖1（b）。

圖1  集成混合微通道的微流控SERS芯片示意圖^{［32-33，35-36］}

Fig.1  Microfluidic SERS chip integrated with mixed microchannels^{［32-33，35-36］}

主動混合式芯片則是通過外力（包括電場、磁場、蠕動泵等）的作用在通道內(nèi)使液體間產(chǎn)生相互運動來達到混合的效果^［34］。雖然主動混合的混合效果優(yōu)于被動混合，但是主動混合式芯片的制備更加復雜，因此根據(jù)需求選擇合理的混合方式是非常有必要的。

液滴微流體芯片為改善顆?；旌闲阅芴峁┝诵碌耐緩?，待測樣本在液滴內(nèi)發(fā)生對流流動，可以直接促進其與納米膠體溶液的混合，避免納米粒子在連續(xù)流動狀態(tài)下沉積聚集，以及在微通道壁上造成的 “記憶效應”等對測定結果產(chǎn)生干擾。Hidi等^［35］研制的液滴SERS微流控芯片（圖1（c））被用于檢測人體尿樣中的硝基唑啉（NTX），其檢出限為0.57 mg/L，線性范圍為0.81~8.13 mg/L。該平臺不僅實現(xiàn)了高通量的多路檢測，而且避免了樣品的交叉污染。Gao等^［36］在如圖1（d）所示的液滴微流控芯片上利用SERS光譜技術對血清中前列腺特異性抗原（PSA）進行了檢測，其檢出限低至10^-4 mg/L。

采用外部注入納米溶膠與待測組分在微流控芯片的微通道中混合的方式，可以實現(xiàn)對待測物拉曼信號的有效增強，但同時也存在混合均勻性難以控制、耗時較長、樣品難分離、通道堵塞以及納米溶膠隨機聚集等問題，這會導致SERS光譜信號的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差，不利于生化樣本的高效檢測^［37］。因此，在固體表面基板上設計固定有序的微納米結構，用于制備微流控SERS芯片引起了人們的關注。

近年來，在微流控芯片的微通道或微腔室中集成SERS增強納米基底的研究備受關注。由于固定納米基底的有序結構，其信號穩(wěn)定性和重現(xiàn)性比基于混合模式的納米溶膠的SERS增強效應更好。目前用于制備固定有序納米增強SERS基底的方法較多，包括：電化學沉積法、電子束光刻法、濺射法、自組裝法等。我們課題組^［38-40］在微流控芯片上制作了多種有序納米結構的SERS增強基底，其中采用電化學沉積法制備的ITO-rGO/Ag和Ag-Au增強基底，分別對羅丹明6G和4-巰基苯甲酸進行了SERS檢測，最低檢出限分別為10^-11 mol/L和10^-10 mol/L。Chen等^［41］以超薄陽極氧化鋁（AAO）薄膜為模板，在石英玻璃片上沉積有序Ag納米點陣作為增強基底，如圖2（a），檢測了濃度為5.0×10^-7 mol/L的腺嘌呤和福美雙。Viehrig等^［42］使用離子蝕刻技術，在硅片上制備納米柱，通過電子束光刻法在柱上形成了厚度為160 nm的Au帽，如圖2（b），實現(xiàn)了牛奶中三聚氰胺的SERS檢測。Zhao等^［43］通過FDTD模擬設計陣列Si的尺寸，利用光刻和納米光刻技術相結合方法，在微流控 SERS芯片內(nèi)制備了高度有序的Ag/Si納米柱陣列，如圖2（c），用于大型生物分子如DNA的檢測，可獲得高度可重復的SERS信號。Galarreta等^［44］采用自上而下納米制造技術，在玻璃表面通過電子束光刻法制備Au三角形納米結構，將其嵌入PDMS制成的微流控通道中，如圖2（d），經(jīng)過適配體序列修飾后，用于對赭曲霉毒素A進行選擇性識別和SERS檢測。Wang等^［45］采用自組裝法制備的NaYF₄∶Yb，Er@SiO₂@Au復合SERS基底集成到“三明治”結構的微流控芯片（圖2（e））上，在近紅外激發(fā)下對R6G和大腸桿菌進行檢測，具有良好的靈敏度和重現(xiàn)性。

圖2  微通道中集成有序納米基底的微流控SERS芯片^［41-45］

Fig.2  Microfluidic SERS chip based on fixed ordered nano-substrate in microchannel^［41-45］

采用“原位制造”方式獲得的微流控SERS芯片，是指直接在微流控通道中進行SERS增強基底的制備，并可在固定的微納米結構處同步實現(xiàn)待測樣本的SERS光譜檢測，常用的制備方法有化學法和飛秒激光技術等^［46］。

我們課題組^［47-49］通過自組裝-化學鍍法在微流控通道中原位制備了多種SERS基底，其中制備的Au@Ag/TIO₂ NTs基底對羅丹明6G的最低檢出限為10^-10 mol/L，增強因子為1.15×10⁸。Parisi等^［50］首先通過原位電沉積Cu核/C鞘納米墻，隨后采用置換法原位合成Ag納米顆粒從而制備了新型納米墻結構的微流控SERS芯片（圖3（a））用于結晶紫檢測，檢出限達5×10^-11 mol/L，SESR增強因子達1.16×10⁹。Wang等^［51］采用化學置換方法，在微通道內(nèi)制備三維Ag枝晶（圖3（b））用于阿莫西林的SERS檢測，檢測限達到10^-3 mg/L。Lawanstiend等^［52］通過化學還原法將AgCl還原為Ag，在微通道中原位制備了具有SERS活性的介孔Ag結構，對唾液中的硫氰酸鹽的檢測限達到了10^-7 mol/L。

圖3  基于微通道中原位制備有序納米基底的微流控SERS芯片^［50-53］

Fig.3  Microfluidic SERS chip based on in-situ preparation of ordered nano-substrate in microfluidic channel^{［42-43，45-46］}

飛秒激光技術是另一種可用于在微流控通道中原位制備三維復雜納米結構襯底的更新穎、強大的技術，其優(yōu)點主要是可以在微流控通道的任何位置精確而靈活地形成各種圖案的納米結構。Xu等^［53］將銀鹽溶液注入芯片的微通道，利用飛秒激光脈沖聚焦于所需位置，將Ag⁺還原制備得到銀納米板，如圖3（c）。后來，他們課題組^［54］用相同的方法制作了銀微花陣列，如圖3（d），用于原位監(jiān)測4-硝基苯酚（4-NP）還原反應，對其還原產(chǎn)物4-氨基苯酚（4-AP）實現(xiàn)了監(jiān)測。Xie等^［55］利用激光熱效應催化原位制備得到高度可控、靈敏的3D Ag@ZnO 納米簇SERS增強基底，由于納米簇完全在激光光斑范圍內(nèi)生長，因此通過移動激光束可實現(xiàn)對三維Ag@ZnO納米簇結構位置的編程控制。

在微通道中原位制備SERS基底可使SERS檢測模式與微流控技術實現(xiàn)完美結合，使整個分析芯片具有多功能一體化和整體集成化的特性。原位制備SERS基底的微流控SERS系統(tǒng)可以實現(xiàn)更可控、更靈活的納米結構基底制備，提供固定的熱點，使樣本的SERS信號具有更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，檢測靈敏度也更高。并且固定的微納米結構可進一步修飾改性，在生化樣本的檢測靈敏度和選擇性提升方面顯示出強大優(yōu)勢。但是這種SERS基底的集成模式對納米微結構制備技術要求較高，同時芯片的清洗難度大，難以重復利用。

致病菌濃度在實際生化樣本中通常很低^［18］，因此對致病菌進行分離富集并減少實際樣品中的雜質(zhì)干擾，進而獲得可靠的致病菌指紋圖譜是進行后續(xù)光譜分析與處理的前提。微流控SERS結合了微流控的微型、高效、自動化和SERS的高靈敏度等優(yōu)勢，可以在微流控芯片上進行細菌分離、富集等預處理，然后進行高靈敏度的SERS檢測，從而實現(xiàn)致病菌的快速檢測識別。微流控芯片中細菌富集方法可以分為兩種，分別是被動分離富集（過濾、慣性微流等^［63-64］）及主動分離富集（離心沉降、介電電泳、光微流控、磁分離富集等^［65-67］）。

被動分離富集是指無外加能量而實現(xiàn)對細菌的分離富集，當前最成熟的方法是多孔膜過濾法。圖4為用于細菌分離富集和檢測的微流控SERS芯片^［68-70］。Krafft等^［68］設計了一種利用納米孔膜實現(xiàn)細菌富集和SERS檢測的三維微流控芯片，如圖4（a），其由納米多孔膜連接的兩個垂直微通道組成，樣品在多孔膜上被電驅(qū)動而流動，將待測細菌和AgNP簇在多孔膜上捕獲、濃縮并進行原位SERS檢測，實現(xiàn)了飲用水中大腸桿菌（2.47×10⁸ Cells/mL）和臺灣假單胞菌（3.8×10⁷ Cells/mL的快速檢測。Chang等^［69］設計了集成膜過濾和SERS增強基底的微流控系統(tǒng)，如圖4（b），在芯片上進行了大腸桿菌的富集、代謝物收集和原位SERS測量，對大腸桿菌的最低檢出限為10³ CFU/mL，比離心純化過程降低了4個數(shù)量級。盡管基于過濾膜的微流控芯片制備比較簡單，但是卻存在吞吐量較低、不可重復使用以及對粘稠度高的生化樣本不適用的問題^［71］。

  

  

  

圖4用于細菌分離富集和檢測的微流控SERS芯片^［68-70］

Fig.4Microfluidic SERS chip for bacteria separated， concentrated and detection^［68-70］

主動分離富集是指通過外加能量，如外加電場、磁場、激光操縱、聲表面波等實現(xiàn)對細菌的分離富集。Cheng等人^{［70，72-73］}研制了多種DEP微流控SERS芯片對細菌進行分離、富集和SERS檢測。他們通過在同心圓微流控器件的中心電極上制作納米Au，如圖4（c），在外加電壓下可從人體血液中快速提取稀有病原菌，并使其富集于芯片SERS增強基底位置上進行SERS檢測，利用獲取的SERS光譜成功識別出了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌，三種菌的的檢出限分別為3×10³、1×10⁴和5×10³ CFU/mL^［70］。Witkowska等人^［74］利用磁分離微流控芯片將牙齦卟啉單胞菌從復雜樣本中分離出來，獲得了更好的牙齦卟啉單胞菌SERS信號。

微流控SERS芯片能夠提供一種高靈敏度及可重復性的檢測條件^{［67，75］}，同時集成微流控SERS平臺可以避免光譜干擾，提高細菌檢測的靈敏度，因此將SERS和微流體器件結合是實現(xiàn)靈敏檢測、可重復性測量及良好定義空間檢測區(qū)域的理想平臺^［37］。當前致病菌主要依賴于SERS標簽（SERS-Tag）進行定量檢測。

Madiyar等^［77］報道了一種DEP微流控SERS芯片，通過在微流控芯片底部嵌入垂直排列的碳納米纖維電極陣列，將SESR-Tag標記的大腸桿菌捕獲和濃縮到200 μm×200 μm區(qū)域上進行SERS檢測，實現(xiàn)了對大腸桿菌的定量檢測，檢測限低至210 CFU/mL，線性范圍為5~10⁹ CFU/mL。Shi等^［79］設計了一種基于SERS的橫向流動免疫分析法的生物傳感器用于快速檢測生物樣品中的大腸桿菌O157∶H7。通過制備經(jīng)兩層拉曼報告分子DTNB和單克隆抗體修飾的金殼二氧化硅核納米球結構作為SERS-Tag，與大腸桿菌O157∶H7有效結合后，在測試紙上形成三明治免疫復合物。通過測量DTNB的特征峰強度，可以輕松實現(xiàn)對大腸桿菌O157∶H7的定量檢測，對PBS溶液中的大腸桿菌O157∶H7的檢測限低至50 Cells/mL，對自來水、牛奶、人尿、生菜提取物和牛肉等生物樣品中大腸桿菌O157∶H7的檢出限為100 Cells/mL。Catala等^［78］設計了一種用于快速超靈敏定量檢測人體體液中金黃色葡萄球菌的微流控芯片，通過檢測經(jīng)抗體或適配體功能化的SERS-Tag的報告分子MBA在1 078 cm^-1處的拉曼峰的強度，實現(xiàn)了對尿液、血液、胸膜積液及腹水中金黃色葡萄球菌的檢測，濃度低于15 CFU/mL。

由于致病微生物主要由拉曼散射截面較小的生物分子構成，拉曼活性較低，并且SERS基底與致病菌的表面接觸有限，采集的SERS光譜不能全面地反映致病菌的指紋信息。因此，細菌檢測的靈敏度和檢測結果的重現(xiàn)性還有待提高。SERS 直接檢測在復雜體系中極易受到干擾信息的影響，因此提高檢測方法的選擇性是 SERS 技術應用于實際復雜檢測體系的關鍵。同時，由于細菌大小只有0.5~1.0 μm，很難將金屬納米粒子引進如此小的細菌中，所以，到目前為止SERS只實現(xiàn)了細菌表面細胞壁的探測^［79］。如何利用SERS檢測的優(yōu)勢，認識并獲取更多致病菌細胞內(nèi)部的化學成分等信息，也將成為研究者們關注的課題。