多藥耐藥基因作用的新發(fā)現(xiàn)-醫(yī)學(xué)論文

在臨床上使用一種化療藥對腫瘤患者實施化療后，治療后的腫瘤細胞可同時對多種不同結(jié)構(gòu)的其他抗癌藥也產(chǎn)生耐藥性，這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥（multi-drugresistance，MDR）。人類腫瘤細胞多藥耐藥的經(jīng)典途徑是由多藥耐藥基因（MDR1Gene）轉(zhuǎn)錄出MDR1mRNA，再由MDR1mRNA翻譯的糖蛋白（P-gp）介導(dǎo)的[1]。這種ATP酶依賴的跨膜蛋白P-gp，有將天然來源的藥物泵出細胞的功能，這可使細胞內(nèi)的藥物濃度降低而導(dǎo)致MDR[2]。臨床上有時患者在外照射后對其后的化療不再敏感，即外照射也表現(xiàn)出了MDR表型。本文主要是觀察被照射的小細胞肺癌細胞系在外照射前后其總RNA、MDR1mRNA、藥物敏感性以及放射敏感性的變化，從而探討多藥耐藥基因是否還有其他未被揭示的新作用。

　　1材料與方法
　　1.1材料
　　上?？茖W(xué)院細胞庫購得NCI-H446小細胞肺癌細胞系。該細胞系的生物學(xué)性狀參見文獻[3]，其培養(yǎng)條件參見文獻[4]。細胞生長進入指數(shù)期后進行實驗。
　　1.2方法
　　1.2.1照射條件采用中國核動力研究設(shè)計院實驗工廠生產(chǎn)的GWGP80型遠距離60Co治療機，照射條件參見文獻[4]。
　　1.2.2細胞的外照射當(dāng)NCI-H446細胞進入指數(shù)生長期后，用0.25%胰酶消化，并將吹勻的細胞懸液移入75ml的細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，等細胞貼壁并匯合后進行外照射，照射劑量為2Gy/次（戈瑞，輻射吸收劑量單位），中間恢復(fù)3d，總的外照射劑量為50Gy[5]。
　　1.2.3外照射前后NCI-H446細胞總RNA的提取分別取照射前后的NCI-H446細胞約1×107個，用PBS將NCI-H446細胞沖洗2遍，離心后棄上清液，各加1mlGibco公司生產(chǎn)的Trizol，吹打使NCI-H446細胞溶解，用氯仿液抽提后，加入異丙醇沉淀，用70%乙醇洗滌，然后涼干，最后加0.1%DEPC水溶解總RNA。提取后的總RNA經(jīng)紫外分光光度計260nm定量。
　　1.2.4RT-PCRRT-PCR的詳細過程參見參考文獻[4]。
　　1.3不同濃度的絲裂霉素（MMC）對外照射前后兩組細胞存活率的影響
　　1.3.1配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC的具體方法參見參考文獻[6]。絲裂霉素的血漿峰濃度為0.5μg/ml[7]。
　　1.3.2制備外照射前后兩組細胞相同濃度的單細胞懸液具體方法參見參考文獻[6]。
　　1.3.3細胞毒性試驗具體方法參見參考文獻[6]。
　　1.3.4不同濃度絲裂霉素作用下兩組細胞的平均存活率細胞存活率的計算公式

　　細胞的平均存活率是每組6個樣本的細胞存活率的平均數(shù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。在相同的條件下細胞的存活率高，提示相對耐藥；反之，則相對敏感。

　　1.4加逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后不同濃度絲裂霉素（MMC）對外照射前后兩組細胞存活率的影響
　　1.4.1配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC方法同本文的“1.3.1”，但不用生理鹽水稀釋，而用細胞培養(yǎng)液1640溶解。
　　1.4.2逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米的配制取12.45ml的1640培養(yǎng)液加50μl的5mg/ml的維拉帕米即可制成濃度為20μg/ml的維拉帕米溶液[9]。
　　1.4.3制備外照射前后兩組細胞的單細胞懸液方法同本文的“1.3.2”。
　　1.4.4細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)實驗具體方法參見參考文獻[6]。
　　1.4.5計算不同濃度絲裂霉素作用下和加入逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后兩組細胞的平均存活率見“1.3.4”所述。

　　1.5外照射前后NCI-H446細胞放射敏感性的變化
　　1.5.1外照射前后NCI-H446細胞存活率（S）的變化實驗分Sc組和Rc組，每組各取3.5cm的細胞培養(yǎng)皿18個。每個培養(yǎng)皿加入細胞300個，再加入1640應(yīng)用液1.5~2.0ml，每組細胞的18個培養(yǎng)皿再分成6小組，每組3個皿。分別給予0、2、4、6、8和10Gy6個不同劑量的外照射。1周后計算兩組細胞的集落形成率（PE）和每小組細胞的存活率（S），并比較兩組細胞的PE和在相同劑量外照射條件下的存活率。同時取原本細胞組的存活率最接近50%的外照射劑量作為下一步實驗的外照射劑量。
1.5.2兩組細胞生長狀況和細胞死亡率的差別[10-11]取Sc和Rc各5組，每組3個培養(yǎng)皿，每個皿中加入指數(shù)生長期細胞1×104個，培養(yǎng)2~3d，使其貼壁并進入指數(shù)生長期，按步驟“1.5.1”確定的2Gy放射劑量作為測試兩組細胞放射敏感性的外照射劑量。使用這個外照射劑量同時一次性照射兩組共30個培養(yǎng)皿的細胞。照射后分別于第2、4、6、8和10天各取1組共6個皿進行細胞計數(shù)，取每組3個皿細胞的平均數(shù)作為最后結(jié)果。每次將做完細胞計數(shù)的剩余單細胞懸液加入離心管，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，然后棄上清液，加入0.5%臺酚藍2~3滴將細胞染色，染色后的細胞點滴在血球計數(shù)板上，分別計數(shù)活細胞（白色）和死亡細胞（藍色），算出細胞死亡率（P）。細胞死亡率的計算公式如下：
　　
　　
　　1.6統(tǒng)計學(xué)方法

　　采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本間均數(shù)比較采用獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2結(jié)果

　　2.1外照射前后NCI-H446細胞的總RNA濃度
　　在相同細胞數(shù)和相同體積的前提下，照射前后NCI-H446細胞總RNA的濃度分別為25.9mg/L和16.6mg/L。

　　2.2外照射前后NCI-H446細胞MDR1mRNA的RT-PCR結(jié)果

　　外照射前后NCI-H446細胞MDR1mRNA的RT-PCR的結(jié)果見圖1。除最上面的條帶Mr（DL2000）外，從上至下可見四條帶，它們依次為未照射細胞的β-actincDNA（簡寫為β-actincDNA）、照射細胞的β-actincDNA（簡寫為P-β-actincDNA）、未照射細胞的MDR1cDNA（簡寫為MDR1cDNA）和照射細胞的MDR1cDNA（簡寫為P-MDR1cDNA）。這四條帶經(jīng)Gelbase電腦軟件進行光密度掃描所得的平均光密度（OD）值分別為59.49、49.76、64.14和66.60。這樣P-MDR1cDNA/P-β-actincDNA為1.388，而MDR1cDNA/β-actincDNA為1.078。
2.3外照射前后兩組細胞在不同濃度絲裂霉素作用下其存活率的變化
2.4外照射前后兩組細胞在加入逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后，其不同濃度絲裂霉素作用下存活率的變化
2.5兩組細胞在不同劑量外照射下的集落形成數(shù)、集落形成率和存活率的結(jié)果

3討論

　　在臨床上，化療和放療是治療腫瘤患者常用的兩種方法，但存在的主要問題是化療后耐藥。在臨床工作中筆者也發(fā)現(xiàn)了另一個現(xiàn)象，即放療后患者有時也會對其后的化療和再放療產(chǎn)生耐受，這個現(xiàn)象引起了筆者的關(guān)注，繼而探討放療是否也會對被照射細胞的MDR1gene有影響，并進而影響其后的藥物敏感性和放射敏感性?；谏鲜鲈?，筆者設(shè)計了本課題，希望通過對體外培養(yǎng)的小細胞肺癌細胞系實施分次外照射，來觀察其對被照射細胞的總RNA和MDR1mRNA的表達變化以及其對被照射細胞的藥物敏感性和放射敏感性所產(chǎn)生的影響，為今后的臨床工作提供基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的根據(jù)。

　　MDR1mRNA是細胞總RNA的組成部分，筆者很關(guān)注對體外培養(yǎng)的細胞在外照射后其總RNA的變化。外照射后對細胞總RNA的生物合成是有影響的，多數(shù)學(xué)者認為外照射后細胞總RNA的生物合成下降；相反的意見也同樣存在。研究者考慮這可能是由于細胞的代謝狀況、生長周期和取樣時間不同所造成的[12]。本實驗表明，細胞受50Gy的外照射后，其總RNA的濃度由25.9mg/L下降到了16.6mg/L，生物合成受到明顯抑制。

　　MDR1mRNA的表達增強是導(dǎo)致MDR的主要原因，因此，探討細胞受外照射后是否導(dǎo)致其后的化療呈MDR表型也應(yīng)該首先觀察外照射后其MDR1mRNA的表達變化。本研究通過對小細胞肺癌NCI-H466細胞系實施分次外照射建立了完成根治性外照射劑量的小細胞肺癌細胞系模型。從結(jié)果中圖1可見，除最上面的條帶Mr（DL2000）外，從上至下可見四條帶，它們依次為未照射細胞的β-actincDNA（簡寫為β-actincDNA）、照射細胞的β-actincDNA（簡寫為P-β-actincDNA）、未照射細胞的MDR1cDNA（簡寫為MDR1cDNA）和照射細胞的MDR1cDNA（簡寫為P-MDR1cDNA）。這四條帶經(jīng)Gelbase電腦軟件進行光密度掃描所得的平均OD值分別為：59.49、49.76、64.14和66.60。這樣P-MDR1cDNA/P-β-actincDNA為1.388，而MDR1cDNA/β-actincDNA為1.078。這兩個比值反映了細胞照射以后和未照射前其MDR1mRNA的相對含量。比值大則反映其MDR1mRNA的表達強。這樣，從結(jié)果中可以看出照射后的比值1.388比照射前的比值1.078明顯增大，表明NCI-H446小細胞肺癌細胞經(jīng)體外總劑量為50Gy的外照射后其MDR1mRNA的表達增強。這意味著此種細胞很有可能對其后的化療耐藥。

　　上面探討了外照射對NCI-H446小細胞肺癌細胞系MDR1mRNA的影響，結(jié)果表明其表達增強，但該細胞是否對其后的化療耐藥尚需做藥敏方面的實驗來證實。本文采用了噻唑藍（MTT）法[6]，實測了兩組細胞在不同濃度化療藥物的干擾下，其各自不同的存活率，從而判斷其不同的藥物敏感性。1983年Mosman[13]首先將MTT法用于細胞毒試驗的檢驗，目前該法廣泛用于體外抗癌藥物敏感試驗?；罴毎t細胞除外）中線粒體脫氫酶對可溶性MTT分解、轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生一種藍紫色結(jié)晶物——甲臜。甲臜溶解于二甲基亞砜（DMSO）中變成紫紅色溶液，在600nm左右波長中測定其顏色的強度，它的顏色和活細胞成正比，因此根據(jù)其顏色的強弱可反映活細胞的多少，從而推算出腫瘤細胞在抗癌藥物中的存活率。腫瘤細胞的存活率越低，說明此種化療藥物對腫瘤細胞殺傷力越強，即敏感性越高，反之則敏感性越低[14]。

　　從本結(jié)果中表1和圖2可見，外照射后的體外細胞，在不同濃度的絲裂霉素作用下，照射后細胞的存活率均明顯高于未照射細胞。此實驗結(jié)果表明，外照射后NCI-H446細胞的體外化療藥物敏感性已經(jīng)降低，換句話說即體外耐藥性提高。日本富田騰朗和美國Salmon等均研究過體外藥物試驗和體內(nèi)臨床用藥的關(guān)系。他們的研究結(jié)果是兩者的相符合率為90%左右[8]。這個結(jié)論表明體外和體內(nèi)細胞的耐藥性關(guān)聯(lián)性很高。從表1和圖2的結(jié)果還可以看到，隨著干擾藥物濃度的提高，兩組細胞的存活率平穩(wěn)地下降，這說明本研究設(shè)計的干擾藥物濃度較為合適。

　　上面的結(jié)果表明外照射后被照射細胞對其后的化療產(chǎn)生了耐藥性。那么這種耐藥性是否也可以被增敏劑所逆轉(zhuǎn)呢？為此，筆者做了如下的實驗，即給已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥的細胞加入了一種常用的化療增敏劑維拉帕米，來觀察其耐藥性是否可以被逆轉(zhuǎn)。從表2可以看到，兩組細胞在加入逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后，在化療藥絲裂霉素的濃度分別為0.1、10和20PPC時，存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），這表明Rc組細胞的耐藥已被逆轉(zhuǎn)；而在絲裂霉素的濃度為1PPC時，Rc組細胞的存活率反而明顯低于未照射的Sc組細胞（P<0.01），這表明Rc組細胞的耐藥表現(xiàn)不僅被逆轉(zhuǎn)，且在這種情況下比Sc組細胞更敏感。實驗結(jié)果說明今后在肺癌化療時可以考慮同時應(yīng)用化療逆轉(zhuǎn)藥物。但有的逆轉(zhuǎn)藥劑量小時不起太多的作用，而劑量大時其帶來的副作用患者又難以忍受，因此，使用受到限制[15]。為了解決這個問題，臨床上曾使用兩種逆轉(zhuǎn)藥物聯(lián)用的辦法，取得了良好的逆轉(zhuǎn)效果[9]。

　　本實驗結(jié)果表明外照射不僅可以使被照射細胞的MDR1mRNA表達增強，而且被照射細胞還對其后的化療藥產(chǎn)生了耐藥性，并且這種耐藥性可以被常規(guī)使用的化療增敏劑所逆轉(zhuǎn)。對外照射后被照射細胞對其后的放療反應(yīng)的問題，筆者對Sc和Rc再給予相同劑量的外照射，來觀察這兩種細胞對相同條件的外照射的反應(yīng)。從表3結(jié)果可知，首先，Sc與Rc的集落形成率（PE）分別為（44.67±17.11）%和（13.11±0.15）%，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明NCI-H446細胞經(jīng)50Gy的外照射后，其集落形成能力下降明顯；其次，在分別給予2Gy和4Gy的外照射后，Rc系的存活率（S）分別為（79.67±34.48）%和（23.73±8.62）%，而Sc系的存活率（S）分別為（51.24±11.88）%和（19.40±5.59）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明在2~4Gy范圍內(nèi)，Rc系較Sc系對外照射的抵御能力增強明顯。提示經(jīng)過外照射后，腫瘤細胞耐外照射的能力增強。臨床上也有這個現(xiàn)象，即在放療過的部位再放療時，效果明顯降低。Fertil等[16]認為測定體外細胞的放射敏感性是判定腫瘤放療反應(yīng)的一個非常有用的指標(biāo)。Williams等[17]也認為測定細胞放射敏感性可預(yù)測臨床放療效果；第三，本實驗表明，當(dāng)放療劑量達8Gy/次或以上時，兩組細胞的存活率（S）均為0。這提示臨床上如果單次放射劑量很大時，照射野內(nèi)的腫瘤細胞有可能被全部殺死，但同時正常細胞可能也難逃厄運。

綜上所述，筆者可以得出如下結(jié)論：外放射可以使體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的MDR1mRNA表達增強；這種被照射細胞由于其MDR1mRNA的表達增強，它對其后的化療藥產(chǎn)生了耐藥性，并且這種耐藥性還可以被化療增敏劑所逆轉(zhuǎn)；不僅如此，被照射的細胞對其后的放療也產(chǎn)生了耐受。表明化療藥以外的損傷因素也可以使多藥耐藥基因表達增強，而這些損傷因素所引起的多藥耐藥基因的高表達均可以使細胞對后來的其他損傷因素（如放療等）產(chǎn)生耐受。因此，多藥耐藥基因應(yīng)改稱耐多種損傷基因似乎更能體現(xiàn)其內(nèi)涵。