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1,25-二羥維生素D3對大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用研究-醫(yī)學(xué)論文

作者:榮智利,張旭,張翠微,高岑,江燕,馬躍榮來源:《中國醫(yī)藥導(dǎo)報》日期:2012-08-08人氣:889
腎間質(zhì)纖維化(renalinterstitialfibrosis,RIF)是一個多步驟、連續(xù)的動態(tài)過程,是各種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期的共同通路和主要病理改變[1],其變化的程度和范圍決定了腎功能的惡化程度[2-4]。單側(cè)輸尿管梗阻(unilateralureteralobstruction,UUO)大鼠是一種經(jīng)典的RIF動物模型,既可短期內(nèi)致使腎間質(zhì)纖維化,模擬慢性腎病時腎間質(zhì)的病理表現(xiàn),又可使病變局限在腎小管和腎間質(zhì),不引起腎小球及其他組織的損傷[5]。近期研究顯示,1,25-二羥維生素D3〔1,25-dihydroxyvitaminD3,1,25-(OH)2D3〕主要通過與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮經(jīng)典的骨鹽調(diào)節(jié)作用,并參與免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控激素分泌和細胞有絲分裂、抑制細胞增殖、分化及凋亡等過程[6]。1,25-(OH)2D3受體可選擇性表達于腎臟的近曲小管、遠曲小管、集合管和髓袢升支[7],但其是否在RIF形成過程中發(fā)揮作用不詳。本研究利用1,25-(OH)2D3干預(yù)UUO大鼠,觀察其對RIF形成有無影響,以探討其在RIF過程中的作用。

1儀器與試藥

  1.1實驗動物

  雄性SD大鼠,45只,8周齡,體重(200±20)g,購自瀘州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

  1.2藥物和主要試劑

  1,25-(OH)2D3(Roche公司,美國),兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(SantaCruz公司,美國),尿蛋白雙縮脲試劑盒(Amresco公司,美國)。

 2方法與結(jié)果

  2.1實驗方法

  2.1.1實驗動物分組及處置45只SD大鼠隨機均分為假手術(shù)組、UUO組和1,25-(OH)2D3干預(yù)組,每組各15只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立UUO大鼠模型[8]。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,局部剃毛和常規(guī)消毒鋪巾,選腹正中切口依次切開皮膚至腹腔,游離腎臟及輸尿管,分別在左側(cè)輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3處用1-0絲線兩次結(jié)扎,剪斷輸尿管,然后逐層連續(xù)縫合皮膚。假手術(shù)組進入腹腔后僅游離腎臟和輸尿管而不結(jié)扎離斷,余手術(shù)方式與UUO組相同。干預(yù)組于術(shù)后第1天起每天腹腔注射30ng/(kg·d)的1,25-(OH)2D3[9],假手術(shù)組及UUO組每天腹腔注射等量生理鹽水。分別于術(shù)后第3、7和14天處死大鼠,每次5只,取梗阻側(cè)腎臟測量其大小及形態(tài),固定包埋后,制片行HE、Masson和α-SMA染色;開胸經(jīng)心臟取血檢測肌酐和尿素氮水平;各組大鼠于處死前1天收集24h尿液,檢測尿蛋白含量。

  2.1.2腎臟病理檢查每張HE、Masson和α-SMA切片隨機選取10個不重復(fù)視野(×200,HPF),組內(nèi)求和取其平均值作為每組最終數(shù)據(jù)。①HE染色判定腎間質(zhì)損傷及纖維化程度:HE切片依據(jù)Radford[10]標準設(shè)定8個參數(shù)指標(腎小管擴張、小管萎縮、小管上皮細胞空泡變性、間質(zhì)水腫、間質(zhì)炎細胞浸潤、間質(zhì)纖維化程度、紅細胞管型、蛋白管型),每個參數(shù)按0~3分評定(0分,正常;1分,輕度受損,病變范圍<15%;2分,中度受損,病變范圍15%~50%;3分,重度受損,病變范圍>50%),由兩個觀察者盲法評分取其平均值,每個樣本的評分為0~24分。②Masson染色判定纖維化程度:Masson染色是用于顯示組織中纖維的一種染色方法,染色切片中膠原纖維呈綠色,肌肉、纖維素和紅細胞均呈紅色,細胞核呈藍色,正常腎組織中僅腎小管基底膜染成綠色。RIF進程中膠原纖維逐步取代正常腎單位,腎實質(zhì)萎縮減少。本實驗通過對膠原纖維染色,運用ImageProPlus6.0圖像分析軟件計算鏡下綠染面積占整個視野的百分比,以了解受損腎臟的纖維化程度。③α-SMA免疫組化染色:在本實驗中α-SMA用于標記肌成纖維細胞(myofibroblast,MFB),其陽性信號為細胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒。運用ImageProPlus6.0圖像分析軟件計算染色陽性細胞的積分光密度值(指將陽性細胞內(nèi)染色量化為綜合面積和灰度值所得到的結(jié)果,其值越大,提示抗原表達水平越高,反之亦然)。

2.1.3腎功能檢測采血后3000r/min離心分離血清,于日本7180型全自動生化分析儀上檢測血肌酐、尿素氮水平(此血生化檢查由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科協(xié)助完成);根據(jù)尿蛋白雙縮脲試劑盒的操作說明,檢測24h尿蛋白含量。

  2.1.4統(tǒng)計學(xué)方法

  用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組間計量資料比較用單因素方差分析(One-wayANOVAtest),兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

  2.2腎臟病理學(xué)改變結(jié)果

  2.2.1肉眼病理改變假手術(shù)組患側(cè)腎臟大小形態(tài)正常;UUO組和干預(yù)組梗阻側(cè)腎臟均明顯腫大,顏色變淺,表面張力增加,有尿液潴留,切面腎實質(zhì)變薄,腎盂腎盞擴張,皮髓質(zhì)分界不清,腎乳頭缺血萎縮,并隨著時間的延長而加重,以UUO組病變更為明顯。

 2.2.2光鏡下病理改變①HE切片假手術(shù)組各時間點腎組織無明顯改變。UUO組術(shù)后第3天腎小管輕度少量擴張,上皮細胞濁腫變性,腎間質(zhì)輕度水腫,伴炎細胞局灶性浸潤;術(shù)后第7天,腎小管進一步擴張,以皮髓交界處尤為明顯,上皮細胞空泡變性,管腔內(nèi)見細胞或蛋白,伴炎細胞彌漫性浸潤和部分小管間質(zhì)輕度纖維化;術(shù)后第14天,皮髓質(zhì)變薄,小管擴張明顯,甚至擴張呈囊性,部分管腔塌陷,上皮細胞空泡變性顯著,出現(xiàn)大量壞死,間質(zhì)內(nèi)巨噬細胞、淋巴細胞彌漫性浸潤和成纖維細胞增生及膠原形成,纖維化明顯,各時間點腎間質(zhì)評分差異明顯,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②Masson切片顯示假手術(shù)組綠染區(qū)域主要位于小管基底膜及其周圍,小管間質(zhì)幾乎無染色。術(shù)后第3天,UUO組皮髓交界區(qū)出現(xiàn)輕度纖維化,并隨著梗阻時間的延長綠染面積擴大,表現(xiàn)為腎間質(zhì)進行性增寬,膠原纖維增加,染色加深,各時間點綠染面積所占百分比比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。③假手術(shù)組α-SMA僅表達于血管平滑肌細胞,腎小球、腎小管及間質(zhì)均未見表達。UUO組術(shù)后第3天可見腎間質(zhì)內(nèi)α-SMA少量表達;術(shù)后第7天腎小管上皮細胞出現(xiàn)陽性表達,皮髓交界處出現(xiàn)輕微纖維化;術(shù)后第14天表達達到高峰,皮質(zhì)區(qū)和皮髓交界區(qū)明顯,各時間點α-SMA的累積光密度值(IOD)比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。④干預(yù)組與假手術(shù)組相比,各時間點各項指標明顯增高;而較之UUO組,各時間點各項指標明顯改善,其腎損傷、間質(zhì)纖維化程度及α-SMA陽性率明顯改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

  表1各組大鼠不同時間點光鏡下病理改變(x±s,n=5)

  注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與UUO組比較,bP<0.05;與第3天比較,cP<0.05;與第7天比較,dP<0.05

  2.3各組腎功能比較結(jié)果

  與假手術(shù)組相比,術(shù)后第3、7和14天UUO組與干預(yù)組肌酐、尿素氮及24h尿蛋白含量均明顯高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),其中第3、7天各指標呈現(xiàn)上升趨勢,第14天時表現(xiàn)為下降;與UUO組相比,干預(yù)組各時間點各項指標明顯改善,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);而假手術(shù)組術(shù)后各時間點各項指標差異不明顯,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

  3討論

  RIF發(fā)生機制錯綜復(fù)雜,可概括為細胞外基質(zhì)增多、腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(epithelialtmesenchymaltransition,EMT)和多種細胞因子及血管活性物質(zhì)的激活與相互作用。近年研究表明,MFB的激活是RIF形成的關(guān)鍵[11],而其中1/3的MFB由EMT而來[12],這種EMT的細胞過度增殖,可分泌多種細胞因子致使細胞外基質(zhì)合成與降解失衡,最終導(dǎo)致RIF的發(fā)生。RIF的病理過程是由病變初期的炎癥細胞浸潤,繼而EMT發(fā)生和腎間質(zhì)成纖維細胞活化增殖,共同產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)并發(fā)生沉積,最后腎小管萎縮消失,小管間質(zhì)纖維化[4]。正常成熟的腎小管上皮細胞表達角蛋白,腎間質(zhì)細胞表達波形蛋白,均無α-SMA的表達;而MFB是成纖維細胞的活化形式,胞漿內(nèi)含肌動蛋白,可表達α-SMA。MFB廣泛存在于纖維化腎組織中,因此α-SMA作為MFB的重要標志,可指示RIF的病理進程[13]。而RIF又與腎功能關(guān)系密切,可作為準確預(yù)測腎功能惡化程度的指標[3]。UUO模型是目前研究RIF最常用的較成熟模型,具有無高血壓、蛋白尿、血脂異常及毒性損害等特點,適合RIF病理機制和防治的研究[5]。1,25-(OH)2D3主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮其多樣生物學(xué)作用,如參與維持鈣磷平衡;與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用,影響基因轉(zhuǎn)錄;與其他激素、生長因子及細胞因子等相互作用,參與聯(lián)系多個信號傳導(dǎo)途徑,從而發(fā)揮復(fù)雜而精細的調(diào)節(jié)作用。有研究表明,腎功能降低與血清中1,25-(OH)2D3的減少呈正比關(guān)系[14]。這就說明1,25-(OH)2D3可通過某些途徑對腎功能起保護作用,減緩腎臟的病理改變。

本實驗結(jié)果顯示,隨著時間延長,UUO組腎間質(zhì)損傷和纖維化程度逐漸加重,α-SMA標記陽性的MFB逐漸增多;至術(shù)后第14天,腎間質(zhì)纖維化明顯,α-SMA表達達到高峰。而肌酐、尿素氮和24h尿蛋白水平于術(shù)后第3、7天與梗阻側(cè)腎臟損傷相平行,各項指標明顯升高;至第14天,各項指標明顯改善,這可能與實驗所取血液為全身血液,而此時健側(cè)腎臟發(fā)揮了全面代償作用有關(guān)。干預(yù)組與UUO組各時間點相比,干預(yù)組各項指標改善明顯。另有體外實驗證明,1,25-(OH)2D3能抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1(tranforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)誘發(fā)的α-SMA表達,并呈劑量依從關(guān)系[15]。TGF-β1是目前已知最強烈的促纖維化因子,可誘導(dǎo)EMT和成纖維細胞活化;而1,25-(OH)2D3的體內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑與TGF-β1存在有廣泛交互的作用[16]。1,25-(OH)2D3在RIF中發(fā)揮保護作用的可能機制是通過拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和減少蛋白尿而實現(xiàn)的。

  RIF是一個多因子參與、多路徑調(diào)控的復(fù)雜病理過程,其機制還有待進一步的研究。本研究對1,25-(OH)2D3在RIF中所起的干預(yù)作用作了初步探討,為進一步研究RIF發(fā)病機制及尋找治療方法提供了一定證據(jù)和思路。

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