1,25-二羥維生素D3對大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用研究-醫(yī)學(xué)論文

腎間質(zhì)纖維化（renalinterstitialfibrosis，RIF）是一個多步驟、連續(xù)的動態(tài)過程，是各種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期的共同通路和主要病理改變[1]，其變化的程度和范圍決定了腎功能的惡化程度[2-4]。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateralureteralobstruction，UUO）大鼠是一種經(jīng)典的RIF動物模型，既可短期內(nèi)致使腎間質(zhì)纖維化，模擬慢性腎病時腎間質(zhì)的病理表現(xiàn)，又可使病變局限在腎小管和腎間質(zhì)，不引起腎小球及其他組織的損傷[5]。近期研究顯示，1，25-二羥維生素D3〔1，25-dihydroxyvitaminD3，1，25-（OH）2D3〕主要通過與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮經(jīng)典的骨鹽調(diào)節(jié)作用，并參與免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控激素分泌和細胞有絲分裂、抑制細胞增殖、分化及凋亡等過程[6]。1，25-（OH）2D3受體可選擇性表達于腎臟的近曲小管、遠曲小管、集合管和髓袢升支[7]，但其是否在RIF形成過程中發(fā)揮作用不詳。本研究利用1，25-（OH）2D3干預(yù)UUO大鼠，觀察其對RIF形成有無影響，以探討其在RIF過程中的作用。

1儀器與試藥

　　1.1實驗動物

　　雄性SD大鼠，45只，8周齡，體重（200±20）g，購自瀘州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

　　1.2藥物和主要試劑

　　1，25-（OH）2D3（Roche公司，美國），兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體（SantaCruz公司，美國），尿蛋白雙縮脲試劑盒（Amresco公司，美國）。

　2方法與結(jié)果

　　2.1實驗方法

　　2.1.1實驗動物分組及處置45只SD大鼠隨機均分為假手術(shù)組、UUO組和1，25-（OH）2D3干預(yù)組，每組各15只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立UUO大鼠模型[8]。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，局部剃毛和常規(guī)消毒鋪巾，選腹正中切口依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，分別在左側(cè)輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3處用1-0絲線兩次結(jié)扎，剪斷輸尿管，然后逐層連續(xù)縫合皮膚。假手術(shù)組進入腹腔后僅游離腎臟和輸尿管而不結(jié)扎離斷，余手術(shù)方式與UUO組相同。干預(yù)組于術(shù)后第1天起每天腹腔注射30ng/（kg·d）的1，25-（OH）2D3[9]，假手術(shù)組及UUO組每天腹腔注射等量生理鹽水。分別于術(shù)后第3、7和14天處死大鼠，每次5只，取梗阻側(cè)腎臟測量其大小及形態(tài)，固定包埋后，制片行HE、Masson和α-SMA染色；開胸經(jīng)心臟取血檢測肌酐和尿素氮水平；各組大鼠于處死前1天收集24h尿液，檢測尿蛋白含量。

　　2.1.2腎臟病理檢查每張HE、Masson和α-SMA切片隨機選取10個不重復(fù)視野（×200，HPF），組內(nèi)求和取其平均值作為每組最終數(shù)據(jù)。①HE染色判定腎間質(zhì)損傷及纖維化程度：HE切片依據(jù)Radford[10]標準設(shè)定8個參數(shù)指標（腎小管擴張、小管萎縮、小管上皮細胞空泡變性、間質(zhì)水腫、間質(zhì)炎細胞浸潤、間質(zhì)纖維化程度、紅細胞管型、蛋白管型），每個參數(shù)按0~3分評定（0分，正常；1分，輕度受損，病變范圍＜15%；2分，中度受損，病變范圍15%～50%；3分，重度受損，病變范圍＞50%），由兩個觀察者盲法評分取其平均值，每個樣本的評分為0～24分。②Masson染色判定纖維化程度：Masson染色是用于顯示組織中纖維的一種染色方法，染色切片中膠原纖維呈綠色，肌肉、纖維素和紅細胞均呈紅色，細胞核呈藍色，正常腎組織中僅腎小管基底膜染成綠色。RIF進程中膠原纖維逐步取代正常腎單位，腎實質(zhì)萎縮減少。本實驗通過對膠原纖維染色，運用ImageProPlus6.0圖像分析軟件計算鏡下綠染面積占整個視野的百分比，以了解受損腎臟的纖維化程度。③α-SMA免疫組化染色：在本實驗中α-SMA用于標記肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB），其陽性信號為細胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒。運用ImageProPlus6.0圖像分析軟件計算染色陽性細胞的積分光密度值（指將陽性細胞內(nèi)染色量化為綜合面積和灰度值所得到的結(jié)果，其值越大，提示抗原表達水平越高，反之亦然）。

2.1.3腎功能檢測采血后3000r/min離心分離血清，于日本7180型全自動生化分析儀上檢測血肌酐、尿素氮水平（此血生化檢查由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科協(xié)助完成）；根據(jù)尿蛋白雙縮脲試劑盒的操作說明，檢測24h尿蛋白含量。

　　2.1.4統(tǒng)計學(xué)方法

　　用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間計量資料比較用單因素方差分析（One-wayANOVAtest），兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2.2腎臟病理學(xué)改變結(jié)果

　　2.2.1肉眼病理改變假手術(shù)組患側(cè)腎臟大小形態(tài)正常；UUO組和干預(yù)組梗阻側(cè)腎臟均明顯腫大，顏色變淺，表面張力增加，有尿液潴留，切面腎實質(zhì)變薄，腎盂腎盞擴張，皮髓質(zhì)分界不清，腎乳頭缺血萎縮，并隨著時間的延長而加重，以UUO組病變更為明顯。

　2.2.2光鏡下病理改變①HE切片假手術(shù)組各時間點腎組織無明顯改變。UUO組術(shù)后第3天腎小管輕度少量擴張，上皮細胞濁腫變性，腎間質(zhì)輕度水腫，伴炎細胞局灶性浸潤；術(shù)后第7天，腎小管進一步擴張，以皮髓交界處尤為明顯，上皮細胞空泡變性，管腔內(nèi)見細胞或蛋白，伴炎細胞彌漫性浸潤和部分小管間質(zhì)輕度纖維化；術(shù)后第14天，皮髓質(zhì)變薄，小管擴張明顯，甚至擴張呈囊性，部分管腔塌陷，上皮細胞空泡變性顯著，出現(xiàn)大量壞死，間質(zhì)內(nèi)巨噬細胞、淋巴細胞彌漫性浸潤和成纖維細胞增生及膠原形成，纖維化明顯，各時間點腎間質(zhì)評分差異明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。②Masson切片顯示假手術(shù)組綠染區(qū)域主要位于小管基底膜及其周圍，小管間質(zhì)幾乎無染色。術(shù)后第3天，UUO組皮髓交界區(qū)出現(xiàn)輕度纖維化，并隨著梗阻時間的延長綠染面積擴大，表現(xiàn)為腎間質(zhì)進行性增寬，膠原纖維增加，染色加深，各時間點綠染面積所占百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。③假手術(shù)組α-SMA僅表達于血管平滑肌細胞，腎小球、腎小管及間質(zhì)均未見表達。UUO組術(shù)后第3天可見腎間質(zhì)內(nèi)α-SMA少量表達；術(shù)后第7天腎小管上皮細胞出現(xiàn)陽性表達，皮髓交界處出現(xiàn)輕微纖維化；術(shù)后第14天表達達到高峰，皮質(zhì)區(qū)和皮髓交界區(qū)明顯，各時間點α-SMA的累積光密度值（IOD）比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。④干預(yù)組與假手術(shù)組相比，各時間點各項指標明顯增高；而較之UUO組，各時間點各項指標明顯改善，其腎損傷、間質(zhì)纖維化程度及α-SMA陽性率明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

　　表1各組大鼠不同時間點光鏡下病理改變（x±s，n=5）

　　注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與UUO組比較，bP＜0.05；與第3天比較，cP＜0.05；與第7天比較，dP＜0.05

　　2.3各組腎功能比較結(jié)果

　　與假手術(shù)組相比，術(shù)后第3、7和14天UUO組與干預(yù)組肌酐、尿素氮及24h尿蛋白含量均明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中第3、7天各指標呈現(xiàn)上升趨勢，第14天時表現(xiàn)為下降；與UUO組相比，干預(yù)組各時間點各項指標明顯改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而假手術(shù)組術(shù)后各時間點各項指標差異不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

　　3討論

　　RIF發(fā)生機制錯綜復(fù)雜，可概括為細胞外基質(zhì)增多、腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化（epithelialtmesenchymaltransition，EMT）和多種細胞因子及血管活性物質(zhì)的激活與相互作用。近年研究表明，MFB的激活是RIF形成的關(guān)鍵[11]，而其中1/3的MFB由EMT而來[12]，這種EMT的細胞過度增殖，可分泌多種細胞因子致使細胞外基質(zhì)合成與降解失衡，最終導(dǎo)致RIF的發(fā)生。RIF的病理過程是由病變初期的炎癥細胞浸潤，繼而EMT發(fā)生和腎間質(zhì)成纖維細胞活化增殖，共同產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)并發(fā)生沉積，最后腎小管萎縮消失，小管間質(zhì)纖維化[4]。正常成熟的腎小管上皮細胞表達角蛋白，腎間質(zhì)細胞表達波形蛋白，均無α-SMA的表達；而MFB是成纖維細胞的活化形式，胞漿內(nèi)含肌動蛋白，可表達α-SMA。MFB廣泛存在于纖維化腎組織中，因此α-SMA作為MFB的重要標志，可指示RIF的病理進程[13]。而RIF又與腎功能關(guān)系密切，可作為準確預(yù)測腎功能惡化程度的指標[3]。UUO模型是目前研究RIF最常用的較成熟模型，具有無高血壓、蛋白尿、血脂異常及毒性損害等特點，適合RIF病理機制和防治的研究[5]。1，25-（OH）2D3主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮其多樣生物學(xué)作用，如參與維持鈣磷平衡；與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響基因轉(zhuǎn)錄；與其他激素、生長因子及細胞因子等相互作用，參與聯(lián)系多個信號傳導(dǎo)途徑，從而發(fā)揮復(fù)雜而精細的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，腎功能降低與血清中1，25-（OH）2D3的減少呈正比關(guān)系[14]。這就說明1，25-（OH）2D3可通過某些途徑對腎功能起保護作用，減緩腎臟的病理改變。

本實驗結(jié)果顯示，隨著時間延長，UUO組腎間質(zhì)損傷和纖維化程度逐漸加重，α-SMA標記陽性的MFB逐漸增多；至術(shù)后第14天，腎間質(zhì)纖維化明顯，α-SMA表達達到高峰。而肌酐、尿素氮和24h尿蛋白水平于術(shù)后第3、7天與梗阻側(cè)腎臟損傷相平行，各項指標明顯升高；至第14天，各項指標明顯改善，這可能與實驗所取血液為全身血液，而此時健側(cè)腎臟發(fā)揮了全面代償作用有關(guān)。干預(yù)組與UUO組各時間點相比，干預(yù)組各項指標改善明顯。另有體外實驗證明，1，25-（OH）2D3能抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1（tranforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）誘發(fā)的α-SMA表達，并呈劑量依從關(guān)系[15]。TGF-β1是目前已知最強烈的促纖維化因子，可誘導(dǎo)EMT和成纖維細胞活化；而1，25-（OH）2D3的體內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑與TGF-β1存在有廣泛交互的作用[16]。1，25-（OH）2D3在RIF中發(fā)揮保護作用的可能機制是通過拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和減少蛋白尿而實現(xiàn)的。

　　RIF是一個多因子參與、多路徑調(diào)控的復(fù)雜病理過程，其機制還有待進一步的研究。本研究對1，25-（OH）2D3在RIF中所起的干預(yù)作用作了初步探討，為進一步研究RIF發(fā)病機制及尋找治療方法提供了一定證據(jù)和思路。