E.coliDH10B堿性磷酸酶基因的克隆、表達及活性研究-醫(yī)學論文

堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）是一類非特異性磷酸單酯酶，可催化磷酸單酯的水解[1]。AKP廣泛存在于多種細菌、真菌和動物中。不同來源的AKP的相對分子質(zhì)量和編碼序列差異很大，且各種AKP的性質(zhì)、結構、功能和催化機制也不完全相同。其中，E.coliAKP由phoA基因編碼，為同源二聚體金屬酶，單體由449個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為47K，活性中心包括3個金屬原子，即2個鋅原子和1個鎂原子[2]。

　　E.coliAKP催化機制明確，底物范圍廣泛，作為工具酶在表位連鎖、組織化學、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應用。E.coliDH10B無致病性和耐藥基因，是基因克隆的常用受體菌。本研究首次從E.coliDH10B基因組中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并進行了表達研究，從而為此種酶的結構、功能和應用研究打下了堅實的基礎。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1菌株、載體大腸桿菌菌株E.coliDH10B、E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5α及原核表達載體pET28a（+）由熱帶生物資源教育部重點實驗室保存。

　　1.1.2試劑T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、對硝基苯磷酸（pNPP）購自生工生物（上海）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、PfuDNA聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司。His標簽蛋白純化試劑盒、重組標簽蛋白快速檢測試劑盒GoldCassette-HIS購自北京康為世紀生物科技有限公司。

　　1.1.3引物引物設計后由生工生物（上海）有限公司合成。

　　1.1.4儀器UV-2450紫外可見分光光度計（島津）；超微量黑色石英比色皿（島津）；PCR擴增儀（2720ThermalCyclerAppliedBiosystems）；凝膠成像系統(tǒng)（BioRad）。

　　1.2方法

　　1.2.1E.coliDH10B基因組DNA的提取與純化E.coliDH10B甘油菌經(jīng)LB培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)后，用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取與純化。提取的基因組DNA用紫外分光光度法進行評價。

　　1.2.2引物設計從Genbank數(shù)據(jù)庫下載E.coliDH10B的phoA基因序列（accessionnumber：NC-010473），使用PrimerPremier6.0和Oligo7.37輔助設計用于擴增AKPphoAm的引物，為便于克隆進表達載體pET28a中，在引物兩端加上適當?shù)拿盖形稽c和保護堿基。設計的引物如下，正向引物（phoAm-F）：5'-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3'（BamHⅠ）；反向引物（phoAm-R）：5'-GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC-3'（HindⅢ）。

　　1.2.3PCR法擴增phoA基因在0.2mlPCR管內(nèi)配制50μl反應體系，按下述程序進行PCR擴增：94℃預變性3min；擴增30個循環(huán)，即94℃30s→55℃30s→72℃2min；72℃延伸5min。反應結束后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行測序。

　　1.2.4phoAm基因的克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，并與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的表達載體pET28a（+）經(jīng)T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)LB/kan篩選平板培養(yǎng)后，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.2.5phoAm基因的誘導表達分別接種pET28a-phoAm/BL21（DE3）和pET28a/BL21（DE3）單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例接種陽性菌液至100mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600nm約為0.4時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)3h。

　　1.2.6重組蛋白（rAKP）的檢測菌體離心后，加入緩沖液超聲破碎，離心取上清液，用免疫金層析法檢測6×His標簽，用SDS-PAGE法檢測表達蛋白。

　　1.2.7重組蛋白（rAKP）的純化采用Ni-AgaroseHis標簽蛋白純化試劑盒進行純化。對洗脫液進行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。

　　1.2.8重組蛋白（rAKP）的活性分析采用對硝基酚磷酸（pNPP）法測定rAKP的活性。取發(fā)酵菌體超聲破碎后的上清液，加入測活液，30℃反應10min，加入終止液終止反應，于波長410nm處測吸收值。

　　2結果

　　2.1PCR擴增E.coliDH10B成熟肽基因（phoA）

　　PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分析，可見1.4kb的條帶（圖1）大小與預期一致。

　　1.DNAMarker；2.PCR產(chǎn)物

　　圖1E.coliDH10BphoAmPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

　　2.2重組蛋白（rAKP）的表達與檢測

　　重組菌誘導表達后，取超聲破碎后的上清液，分別用免疫金層析法快速檢測6×His標簽（圖2），用SDS-PAGE法檢測表達蛋白（圖3）。rAKP的分子量約為47K。

　　1：陰性對照；2：rAKP（含6×His標簽）

　　圖2免疫金層析法快速檢測His標簽蛋白

　　從左至右分別為誘導0、2、4h；第4泳道為蛋白質(zhì)分子量Marker

　　圖3SDS-PAGE檢測誘導表達的rAKP

　　2.3重組蛋白（rAKP）的活性分析

　　rAKP經(jīng)活性分析，對照菌E.coliBL21（DE3）的OD405nm為0.120，重組菌E.coliBL21（DE3）/phoAm的OD405nm為2.58，即重組菌的堿性磷酸酶活性提高21.5倍。

　　3討論

　　本研究首次從E.coliDH10B菌株的基因組中克隆了堿性磷酸酶成熟肽基因，并進行了表達、純化與活性研究。E.coliAKP作為工具酶在表位連鎖、組織化學、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應用。目前市場上常見的AKP產(chǎn)品有蝦堿性磷酸酶（SAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP），其中CIAP的活性最高，約為天然E.coliAKP的40倍[3]。與天然提純的SAP和CIAP相比，E.coliAKP的生產(chǎn)成本低，熱穩(wěn)定性好。由于AKP的構效關系明確，且在定點誘變和結構改造方面積累了一定的經(jīng)驗[4-5]。進一步研究可結合計算機模擬對E.coliAKP的三維結構與催化活性之間的關系進行深入分析[6]，利用當前蛋白質(zhì)工程的先進技術手段對重組E.coliAKP進一步改構。