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E.coliDH10B堿性磷酸酶基因的克隆、表達及活性研究-醫(yī)學論文

作者:李軍,黃霞,姚雪梅,陳雪芬,齊興柱來源:《中國醫(yī)藥導報》日期:2012-08-08人氣:1118
堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)是一類非特異性磷酸單酯酶,可催化磷酸單酯的水解[1]。AKP廣泛存在于多種細菌、真菌和動物中。不同來源的AKP的相對分子質(zhì)量和編碼序列差異很大,且各種AKP的性質(zhì)、結構、功能和催化機制也不完全相同。其中,E.coliAKP由phoA基因編碼,為同源二聚體金屬酶,單體由449個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量為47K,活性中心包括3個金屬原子,即2個鋅原子和1個鎂原子[2]。

  E.coliAKP催化機制明確,底物范圍廣泛,作為工具酶在表位連鎖、組織化學、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應用。E.coliDH10B無致病性和耐藥基因,是基因克隆的常用受體菌。本研究首次從E.coliDH10B基因組中克隆了AKP的成熟肽基因(phoAm)并進行了表達研究,從而為此種酶的結構、功能和應用研究打下了堅實的基礎。

  1材料與方法

  1.1材料

  1.1.1菌株、載體大腸桿菌菌株E.coliDH10B、E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α及原核表達載體pET28a(+)由熱帶生物資源教育部重點實驗室保存。

  1.1.2試劑T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、對硝基苯磷酸(pNPP)購自生工生物(上海)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、PfuDNA聚合酶購自天根生化科技(北京)有限公司。His標簽蛋白純化試劑盒、重組標簽蛋白快速檢測試劑盒GoldCassette-HIS購自北京康為世紀生物科技有限公司。

  1.1.3引物引物設計后由生工生物(上海)有限公司合成。

  1.1.4儀器UV-2450紫外可見分光光度計(島津);超微量黑色石英比色皿(島津);PCR擴增儀(2720ThermalCyclerAppliedBiosystems);凝膠成像系統(tǒng)(BioRad)。

  1.2方法

  1.2.1E.coliDH10B基因組DNA的提取與純化E.coliDH10B甘油菌經(jīng)LB培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)后,用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取與純化。提取的基因組DNA用紫外分光光度法進行評價。

  1.2.2引物設計從Genbank數(shù)據(jù)庫下載E.coliDH10B的phoA基因序列(accessionnumber:NC-010473),使用PrimerPremier6.0和Oligo7.37輔助設計用于擴增AKPphoAm的引物,為便于克隆進表達載體pET28a中,在引物兩端加上適當?shù)拿盖形稽c和保護堿基。設計的引物如下,正向引物(phoAm-F):5'-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3'(BamHⅠ);反向引物(phoAm-R):5'-GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC-3'(HindⅢ)。

  1.2.3PCR法擴增phoA基因在0.2mlPCR管內(nèi)配制50μl反應體系,按下述程序進行PCR擴增:94℃預變性3min;擴增30個循環(huán),即94℃30s→55℃30s→72℃2min;72℃延伸5min。反應結束后,0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行測序。

  1.2.4phoAm基因的克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,并與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的表達載體pET28a(+)經(jīng)T4DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)LB/kan篩選平板培養(yǎng)后,用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.2.5phoAm基因的誘導表達分別接種pET28a-phoAm/BL21(DE3)和pET28a/BL21(DE3)單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例接種陽性菌液至100mlLB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng),至菌液OD600nm約為0.4時,加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導,繼續(xù)培養(yǎng)3h。

  1.2.6重組蛋白(rAKP)的檢測菌體離心后,加入緩沖液超聲破碎,離心取上清液,用免疫金層析法檢測6×His標簽,用SDS-PAGE法檢測表達蛋白。

  1.2.7重組蛋白(rAKP)的純化采用Ni-AgaroseHis標簽蛋白純化試劑盒進行純化。對洗脫液進行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。

  1.2.8重組蛋白(rAKP)的活性分析采用對硝基酚磷酸(pNPP)法測定rAKP的活性。取發(fā)酵菌體超聲破碎后的上清液,加入測活液,30℃反應10min,加入終止液終止反應,于波長410nm處測吸收值。

  2結果

  2.1PCR擴增E.coliDH10B成熟肽基因(phoA)

  PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分析,可見1.4kb的條帶(圖1)大小與預期一致。

  1.DNAMarker;2.PCR產(chǎn)物

  圖1E.coliDH10BphoAmPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

  2.2重組蛋白(rAKP)的表達與檢測

  重組菌誘導表達后,取超聲破碎后的上清液,分別用免疫金層析法快速檢測6×His標簽(圖2),用SDS-PAGE法檢測表達蛋白(圖3)。rAKP的分子量約為47K。

  1:陰性對照;2:rAKP(含6×His標簽)

  圖2免疫金層析法快速檢測His標簽蛋白

  從左至右分別為誘導0、2、4h;第4泳道為蛋白質(zhì)分子量Marker

  圖3SDS-PAGE檢測誘導表達的rAKP

  2.3重組蛋白(rAKP)的活性分析

  rAKP經(jīng)活性分析,對照菌E.coliBL21(DE3)的OD405nm為0.120,重組菌E.coliBL21(DE3)/phoAm的OD405nm為2.58,即重組菌的堿性磷酸酶活性提高21.5倍。

  3討論

  本研究首次從E.coliDH10B菌株的基因組中克隆了堿性磷酸酶成熟肽基因,并進行了表達、純化與活性研究。E.coliAKP作為工具酶在表位連鎖、組織化學、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應用。目前市場上常見的AKP產(chǎn)品有蝦堿性磷酸酶(SAP)和牛小腸堿性磷酸酶(CIAP),其中CIAP的活性最高,約為天然E.coliAKP的40倍[3]。與天然提純的SAP和CIAP相比,E.coliAKP的生產(chǎn)成本低,熱穩(wěn)定性好。由于AKP的構效關系明確,且在定點誘變和結構改造方面積累了一定的經(jīng)驗[4-5]。進一步研究可結合計算機模擬對E.coliAKP的三維結構與催化活性之間的關系進行深入分析[6],利用當前蛋白質(zhì)工程的先進技術手段對重組E.coliAKP進一步改構。

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