甘草次酸衍生物TY501對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響-醫(yī)學(xué)論文
通過(guò)小鼠灌胃給藥,研究TY501對(duì)小鼠體重和中樞免疫器官胸腺、脾臟的影響,采用ADVIA2120血液分析儀測(cè)定小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量及比例,采用BDFACSAriaTMⅡ流式細(xì)胞儀測(cè)定藥物對(duì)小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞型的影響,探究并比較TY501與潑尼松龍對(duì)免疫系統(tǒng)影響的差異。
1儀器與試藥
1.1試驗(yàn)藥物
TY501:白色粉末,含量為97.8%,批號(hào)為20100512,天津藥物研究院化學(xué)制藥研究部提供。試驗(yàn)前用精制玉米油配制成適當(dāng)濃度,供動(dòng)物灌胃給藥。
潑尼松龍:白色結(jié)晶粉末,含量98.2%,批號(hào)為PL100107,天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成適當(dāng)濃度,供動(dòng)物灌胃給藥。
1.2動(dòng)物
ICR小鼠,雌雄各半,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)小鼠體重均為18~22g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(京)2006-0009。飼料為鼠專用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)塊料(天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司生產(chǎn))。動(dòng)物均飼養(yǎng)在有中央空調(diào)的觀察室,飲用動(dòng)物飲用水。
1.3主要試劑及儀器
精制玉米油(華北制藥康欣有限公司生產(chǎn),規(guī)格5L/桶,批號(hào):081203),羧甲基纖維素鈉300~800M[國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),規(guī)格化學(xué)純(CP)500g,批號(hào):20081015],染色檢測(cè)試劑(PerCPHamsterAnti-MouseCD3e;FITCRatAnti-MouseCD4;PERatAnti-MouseCD8a;PerCPHamsterIgG1,kIsotype;FITCRatIgG2,kIsotypeControl;PERatIgG2a,kIsotypeControl;PEMouseAnti-MouseNK1.1;FITCRatAnti-MouseCD19;PEMouseIgG2a,kIsotypeControl。所有染色試劑均為BDPharmingen公司提供流式專用試劑),流式細(xì)胞儀專用鞘液(BDFACSFlow鞘液,規(guī)格:20L,批號(hào):1015300043)。
電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,PL203],電子天平[(美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司常熟雙杰測(cè)試儀器廠,T2000)],血液分析儀(SiemensHealthcareDiagnosticsInc,ADVIA2120),流式細(xì)胞儀(bdbiosciences.com,BDFACSAriaTMⅡ)
2方法與結(jié)果
2.1實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)設(shè)5組,每組10只動(dòng)物,雌雄各半。分別為正常對(duì)照組、潑尼松龍組(15.0mg/kg)、TY501低劑量組(6.7mg/kg)、T501中劑量組(20.0mg/kg)、TY501高劑量組(60.0mg/kg)。正常對(duì)照組給予動(dòng)物飲用水;潑尼松龍組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的濃度為0.75mg/ml的混懸液;TY501低、中、高劑量組分別灌胃給予精制玉米油配制的濃度為0.33、1.00、3.00mg/mL的混懸液。各組分別連續(xù)灌服相應(yīng)的藥物23d,給藥體積均為20mL/kg。于給藥后第0、7、14、21天分別稱量動(dòng)物體重;末次給藥24h后,用毛細(xì)管從眼眶靜脈叢采血,0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,采用ADVIA2120血液分析儀測(cè)定小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量及比例,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血中淋巴細(xì)胞亞型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NK1.1的比例;通過(guò)白細(xì)胞分類中淋巴細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞亞型的比例計(jì)算外周血中各淋巴細(xì)胞亞型的數(shù)量;稱量動(dòng)物體重,剖殺并稱取脾臟、胸腺,計(jì)算臟器指數(shù)。
2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.3結(jié)果
2.3.1對(duì)小鼠體重、胸腺、脾臟的影響結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,給藥第7天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),潑尼松龍組動(dòng)物體重明顯降低(P<0.01或P<0.001);TY501各劑量對(duì)動(dòng)物體重未見(jiàn)明顯的變化。與正常對(duì)照組比較,潑尼松龍組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)明顯降低(P<0.001),說(shuō)明潑尼松龍對(duì)小鼠中樞免疫器官具有明顯的抑制作用;TY501各劑量組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)未見(jiàn)明顯的變化,提示TY501各劑量組未對(duì)小鼠中樞免疫器官起到明顯的抑制作用。見(jiàn)表1、2。
2.3.2對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的影響與正常對(duì)照組比較,潑尼松龍組白細(xì)胞總數(shù)未見(jiàn)明顯變化,淋巴細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.01),僅比正常對(duì)照組的50%略高,這與表2得到的脾臟、胸腺重量及系數(shù)降低相一致;嗜中性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.001),可能原因?yàn)閯?dòng)物由于免疫力下降存在隱性感染所致。TY501低、中劑量組對(duì)小鼠白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)均未見(jiàn)明顯變化,未出現(xiàn)與潑尼松龍組相類似的使小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)顯著下降的影響;TY501高劑量組白細(xì)胞數(shù)及嗜中性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05或P<0.01),可能是TY501毒性反應(yīng)的結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表3。
2.3.3對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞型的影響與正常對(duì)照組比較,潑尼松龍組給藥后CD3+T總淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01或P<0.001),CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.001),但結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量計(jì)算T淋巴細(xì)胞及其各亞型的數(shù)量發(fā)現(xiàn),外周血中T總淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量不僅沒(méi)有升高,反而降低,各亞型T淋巴細(xì)胞中又以CD3+CD4+數(shù)量減少為主,CD3+CD8+數(shù)量沒(méi)有明顯變化,CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例與數(shù)量均顯著降低(P<0.001)(表5),說(shuō)明潑尼松龍對(duì)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫均有明顯的抑制作用。與正常對(duì)照組比較,TY501中、高劑量組給藥后CD3-CD19+亞型淋巴細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05或P<0.01),結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量計(jì)算發(fā)現(xiàn)各組B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)量增多,說(shuō)明TY501有增強(qiáng)體液免疫和非特異性免疫功能的趨勢(shì);由于CD3-CD19+亞型淋巴細(xì)胞比例顯著升高致使CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例均有所降低(P<0.05或P<0.01),CD4+/CD8+比值基本未有變化,結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量計(jì)算T淋巴細(xì)胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,TY501各劑量組給藥后T淋巴細(xì)胞數(shù)均沒(méi)有降低,反而有所升高,但僅TY501低劑量組和TY501高劑量組的NK1.1值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4、5。
3討論
本研究結(jié)果表明,潑尼松龍持續(xù)灌胃給藥21d,對(duì)動(dòng)物中樞免疫器官的發(fā)育生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用,胸腺、脾萎縮,重量及指數(shù)顯著降低,外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,CD4+/CD8+比例顯著降低(P<0.001);CD3+CD8+亞型T細(xì)胞按其生物學(xué)功能又可分為抑制性細(xì)胞Ts或細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL),其中Ts細(xì)胞可通過(guò)自身及分泌抑制因子在免疫反應(yīng)中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用,抑制B細(xì)胞和CD3+CD4+細(xì)胞的功能,從而抑制抗體形成及細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]。結(jié)合血液學(xué)測(cè)定儀和流式細(xì)胞儀測(cè)得的各亞型淋巴細(xì)胞的比例及計(jì)算各亞型淋巴細(xì)胞的數(shù)量結(jié)果顯示,CD3+CD4+亞型淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05),B淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.001),說(shuō)明潑尼松龍對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用,尤其對(duì)體液免疫功能抑制作用更為顯著,這與有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道相一致[8]。糖皮質(zhì)激素是強(qiáng)效的抗炎藥物,臨床上廣泛應(yīng)用,但由于其免疫抑制作用限制了它的臨床應(yīng)用。開(kāi)發(fā)新型糖皮質(zhì)激素類藥物,在保留其抗炎活性的同時(shí)減少副作用尤為迫切,是近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外藥物學(xué)家一直致力于研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[9]。
TY501持續(xù)灌胃給藥21d,對(duì)小鼠中樞免疫器官、外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例、淋巴細(xì)胞亞型等均未產(chǎn)生抑制作用。甘草酸和甘草次酸是甘草中含量最高的苷類化合物,也是甘草的主要甜味成分[10]。TY501為甘草次酸衍生物,具有甾體類似結(jié)構(gòu),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明劑量為6.0mg/kg時(shí)TY501對(duì)冰醋酸致炎性滲出、角叉菜膠性足腫等小鼠急性炎癥具有最佳抗炎作用;在0.33mg/kg時(shí)多次給藥對(duì)慢性炎癥模型大鼠棉球肉芽腫即有顯著的抑制作用,其抗炎作用與潑尼松龍相當(dāng)(本課題組藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)表資料)。與甾體類藥物(潑尼松龍)相比,TY501在保留了相當(dāng)強(qiáng)的抗炎活性的同時(shí),對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用,使其有望進(jìn)一步被開(kāi)發(fā)成為有鮮明特色的抗炎藥物。
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