甘草次酸衍生物TY501對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響-醫(yī)學(xué)論文

通過(guò)小鼠灌胃給藥，研究TY501對(duì)小鼠體重和中樞免疫器官胸腺、脾臟的影響，采用ADVIA2120血液分析儀測(cè)定小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量及比例，采用BDFACSAriaTMⅡ流式細(xì)胞儀測(cè)定藥物對(duì)小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞型的影響，探究并比較TY501與潑尼松龍對(duì)免疫系統(tǒng)影響的差異。

　　1儀器與試藥

　　1.1試驗(yàn)藥物

　　TY501：白色粉末，含量為97.8%，批號(hào)為20100512，天津藥物研究院化學(xué)制藥研究部提供。試驗(yàn)前用精制玉米油配制成適當(dāng)濃度，供動(dòng)物灌胃給藥。
　　潑尼松龍：白色結(jié)晶粉末，含量98.2%，批號(hào)為PL100107，天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成適當(dāng)濃度，供動(dòng)物灌胃給藥。

　　1.2動(dòng)物

　　ICR小鼠，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)小鼠體重均為18～22g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0009。飼料為鼠專用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)塊料（天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司生產(chǎn)）。動(dòng)物均飼養(yǎng)在有中央空調(diào)的觀察室，飲用動(dòng)物飲用水。

　　1.3主要試劑及儀器

　　精制玉米油（華北制藥康欣有限公司生產(chǎn)，規(guī)格5L/桶，批號(hào)：081203），羧甲基纖維素鈉300～800M[國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，規(guī)格化學(xué)純（CP）500g，批號(hào)：20081015]，染色檢測(cè)試劑（PerCPHamsterAnti-MouseCD3e；FITCRatAnti-MouseCD4；PERatAnti-MouseCD8a；PerCPHamsterIgG1，kIsotype；FITCRatIgG2，kIsotypeControl；PERatIgG2a，kIsotypeControl；PEMouseAnti-MouseNK1.1；FITCRatAnti-MouseCD19；PEMouseIgG2a，kIsotypeControl。所有染色試劑均為BDPharmingen公司提供流式專用試劑），流式細(xì)胞儀專用鞘液（BDFACSFlow鞘液，規(guī)格：20L，批號(hào)：1015300043）。

　　電子天平[梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司，PL203]，電子天平[（美國(guó)雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司常熟雙杰測(cè)試儀器廠，T2000）]，血液分析儀（SiemensHealthcareDiagnosticsInc，ADVIA2120），流式細(xì)胞儀（bdbiosciences.com，BDFACSAriaTMⅡ）

　　2方法與結(jié)果

　　2.1實(shí)驗(yàn)方法

　　實(shí)驗(yàn)設(shè)5組，每組10只動(dòng)物，雌雄各半。分別為正常對(duì)照組、潑尼松龍組（15.0mg/kg）、TY501低劑量組（6.7mg/kg）、T501中劑量組（20.0mg/kg）、TY501高劑量組（60.0mg/kg）。正常對(duì)照組給予動(dòng)物飲用水；潑尼松龍組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的濃度為0.75mg/ml的混懸液；TY501低、中、高劑量組分別灌胃給予精制玉米油配制的濃度為0.33、1.00、3.00mg/mL的混懸液。各組分別連續(xù)灌服相應(yīng)的藥物23d，給藥體積均為20mL/kg。于給藥后第0、7、14、21天分別稱量動(dòng)物體重；末次給藥24h后，用毛細(xì)管從眼眶靜脈叢采血，0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用ADVIA2120血液分析儀測(cè)定小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量及比例，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血中淋巴細(xì)胞亞型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NK1.1的比例；通過(guò)白細(xì)胞分類中淋巴細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞亞型的比例計(jì)算外周血中各淋巴細(xì)胞亞型的數(shù)量；稱量動(dòng)物體重，剖殺并稱取脾臟、胸腺，計(jì)算臟器指數(shù)。

　　2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　2.3結(jié)果

　　2.3.1對(duì)小鼠體重、胸腺、脾臟的影響結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，給藥第7天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，潑尼松龍組動(dòng)物體重明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）；TY501各劑量對(duì)動(dòng)物體重未見(jiàn)明顯的變化。與正常對(duì)照組比較，潑尼松龍組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)明顯降低（P＜0.001），說(shuō)明潑尼松龍對(duì)小鼠中樞免疫器官具有明顯的抑制作用；TY501各劑量組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)未見(jiàn)明顯的變化，提示TY501各劑量組未對(duì)小鼠中樞免疫器官起到明顯的抑制作用。見(jiàn)表1、2。

　　2.3.2對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的影響與正常對(duì)照組比較，潑尼松龍組白細(xì)胞總數(shù)未見(jiàn)明顯變化，淋巴細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.01），僅比正常對(duì)照組的50%略高，這與表2得到的脾臟、胸腺重量及系數(shù)降低相一致；嗜中性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.001），可能原因?yàn)閯?dòng)物由于免疫力下降存在隱性感染所致。TY501低、中劑量組對(duì)小鼠白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)均未見(jiàn)明顯變化，未出現(xiàn)與潑尼松龍組相類似的使小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)顯著下降的影響；TY501高劑量組白細(xì)胞數(shù)及嗜中性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），可能是TY501毒性反應(yīng)的結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表3。

　　2.3.3對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞型的影響與正常對(duì)照組比較，潑尼松龍組給藥后CD3+Ｔ總淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+Ｔ淋巴細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.01或P＜0.001），CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.001），但結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量計(jì)算Ｔ淋巴細(xì)胞及其各亞型的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，外周血中Ｔ總淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量不僅沒(méi)有升高，反而降低，各亞型Ｔ淋巴細(xì)胞中又以CD3+CD4+數(shù)量減少為主，CD3+CD8+數(shù)量沒(méi)有明顯變化，CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例與數(shù)量均顯著降低（P＜0.001）（表5），說(shuō)明潑尼松龍對(duì)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫均有明顯的抑制作用。與正常對(duì)照組比較，TY501中、高劑量組給藥后CD3-CD19+亞型淋巴細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量計(jì)算發(fā)現(xiàn)各組B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)量增多，說(shuō)明TY501有增強(qiáng)體液免疫和非特異性免疫功能的趨勢(shì)；由于CD3-CD19+亞型淋巴細(xì)胞比例顯著升高致使CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+Ｔ淋巴細(xì)胞比例均有所降低（P＜0.05或P＜0.01），CD4+/CD8+比值基本未有變化，結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量計(jì)算Ｔ淋巴細(xì)胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，TY501各劑量組給藥后Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)均沒(méi)有降低，反而有所升高，但僅TY501低劑量組和TY501高劑量組的NK1.1值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4、5。

　　3討論

　　本研究結(jié)果表明，潑尼松龍持續(xù)灌胃給藥21d，對(duì)動(dòng)物中樞免疫器官的發(fā)育生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，胸腺、脾萎縮，重量及指數(shù)顯著降低，外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比例顯著降低（P＜0.001）；CD3+CD8+亞型T細(xì)胞按其生物學(xué)功能又可分為抑制性細(xì)胞Ts或細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），其中Ts細(xì)胞可通過(guò)自身及分泌抑制因子在免疫反應(yīng)中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，抑制B細(xì)胞和CD3+CD4+細(xì)胞的功能，從而抑制抗體形成及細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]。結(jié)合血液學(xué)測(cè)定儀和流式細(xì)胞儀測(cè)得的各亞型淋巴細(xì)胞的比例及計(jì)算各亞型淋巴細(xì)胞的數(shù)量結(jié)果顯示，CD3+CD4+亞型淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05），B淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.001），說(shuō)明潑尼松龍對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，尤其對(duì)體液免疫功能抑制作用更為顯著，這與有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道相一致[8]。糖皮質(zhì)激素是強(qiáng)效的抗炎藥物，臨床上廣泛應(yīng)用，但由于其免疫抑制作用限制了它的臨床應(yīng)用。開(kāi)發(fā)新型糖皮質(zhì)激素類藥物，在保留其抗炎活性的同時(shí)減少副作用尤為迫切，是近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外藥物學(xué)家一直致力于研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[9]。

　　TY501持續(xù)灌胃給藥21d，對(duì)小鼠中樞免疫器官、外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例、淋巴細(xì)胞亞型等均未產(chǎn)生抑制作用。甘草酸和甘草次酸是甘草中含量最高的苷類化合物，也是甘草的主要甜味成分[10]。TY501為甘草次酸衍生物，具有甾體類似結(jié)構(gòu)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明劑量為6.0mg/kg時(shí)TY501對(duì)冰醋酸致炎性滲出、角叉菜膠性足腫等小鼠急性炎癥具有最佳抗炎作用；在0.33mg/kg時(shí)多次給藥對(duì)慢性炎癥模型大鼠棉球肉芽腫即有顯著的抑制作用，其抗炎作用與潑尼松龍相當(dāng)（本課題組藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)表資料）。與甾體類藥物（潑尼松龍）相比，TY501在保留了相當(dāng)強(qiáng)的抗炎活性的同時(shí)，對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用，使其有望進(jìn)一步被開(kāi)發(fā)成為有鮮明特色的抗炎藥物。