葡萄糖濃度波動對INS-1細胞胰島素分泌的影響-醫(yī)學(xué)論文
高糖分為持續(xù)性高糖及波動性高糖,研究發(fā)現(xiàn)波動性高糖同樣可以導(dǎo)致嚴重的胰島素分泌功能的損傷[1-2],其機制并未完全研究清楚。細胞ATP是近年來研究的熱點,近年來發(fā)現(xiàn)胰島素的分泌和胰島β細胞內(nèi)的ATP含量關(guān)系密切[3-4]。本實驗擬用含不同葡萄糖濃度及是否含抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)的培養(yǎng)液干預(yù)INS-1 細胞,通過比較持續(xù)性高糖及波動性高糖對ATP生成的影響及影響機制。
1 材料與方法
1.1 材料
RPMI 1640-培養(yǎng)基購自GIBAO,胎牛血清購自上海微科生化試劑有限公司,N-乙酰半胱氨酸及ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) INS-1細胞貼壁生長于含有10%胎牛血清、0.6 mol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、1 mmol/L 丙酮酸鈉、50 mol/L 2-巰基乙醇的普通RPMI 1640-培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。
1.2.2 實驗分組 將INS-1細胞隨機分為正常糖組(5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng))、持續(xù)高糖組(16.7 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng))、波動組(用16.7 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h,再換5.5 mmol/L培養(yǎng)3 h,每天重復(fù)3次,夜間9 h維持在5.5 mmol/L的培養(yǎng)液中)、NAC+正常糖組、NAC+持續(xù)高糖組、NAC+波動組,后3組的培養(yǎng)基中均預(yù)先負載終濃度為1.0 mmol/L NAC,余干預(yù)措施相同,均干預(yù)72 h。每組5個培養(yǎng)皿。各組每日均同時更換培養(yǎng)基以保持相同的處理條件,培養(yǎng)基事先恒溫箱37 ℃水浴,以減少對細胞的損傷。
1.2.3 測定的指標(biāo)及方法 分組干預(yù)結(jié)束后,用熒光素酶法檢定細胞ATP含量,分別用2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖各刺激INS-1細胞1 h,收集上清后放免法測定其胰島素分泌水平,分別作為基礎(chǔ)和高糖刺激下胰島素釋放,計算高糖刺激胰島素分泌/基礎(chǔ)胰島素分泌作為胰島素分泌能力結(jié)果。結(jié)果均以胰島細胞總蛋白校正。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法
數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(x±s)表示,采用方差分析,各組內(nèi)均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若方差不齊采用Welch近似方差分析;多重比較采用LSD法(Least-significant difference test),兩兩比較用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對INS-1 細胞胰島素分泌水平的影響
六組基礎(chǔ)胰島素分泌(2.8 mmol/L 葡萄糖刺激)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05),高糖刺激胰島素分泌(16.7 mmol/L葡萄糖刺激)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。見表1。
表1 六組INS-1細胞的基礎(chǔ)胰島素分泌及高糖胰島素分泌(x±s,n=5)
2.2 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對INS-1 細胞ATP含量及胰島素分泌能力的影響
由表2可知,與正常糖組相比,持續(xù)性高糖組及波動組的胞內(nèi)ATP含量及胰島素分泌能力顯著下降(P < 0.01),且波動組下降更明顯。使用抗氧化劑NAC干預(yù)持續(xù)性高糖組及波動組,兩組的細胞ATP含量及胰島素分泌能力均較未使用組顯著增加(P < 0.05)。
3 討論
近年來,血糖波動的危害越來越受到關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)波動性高血糖不僅促進糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[5-7],也可損傷β細胞的胰島素分泌功能[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn),波動性高糖及持續(xù)性高糖均可損傷INS-1細胞的胰島素分泌能力,且波動性高糖更嚴重。
已有研究發(fā)現(xiàn),胰島β細胞胰島素分泌與ATP合成相偶聯(lián)[3-4]。葡萄糖刺激胰島素分泌的重要機制是葡萄糖增加ATP的合成,減少游離二磷酸腺苷,導(dǎo)致ATP敏感性K+通道關(guān)閉,細胞去極化,Ca2+通過鈣電壓門控通道內(nèi)流,并產(chǎn)生一系列的級聯(lián)放大效應(yīng)使胰島素分泌顆粒胞吐,胰島素分泌到細胞外[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATP含量在持續(xù)性高糖組及波動組均較正常糖組顯著下降,且波動組下降更明顯。本研究提示,波動性高糖及持續(xù)性高糖可能通過降低INS-1細胞的ATP生成降低其胰島素分泌能力,且波動性高糖更嚴重。
高糖可引起胰島β細胞功能紊亂,胰島素分泌功能受損,其機制較復(fù)雜。近年來大量文獻證實氧化應(yīng)激在β細胞的損傷中發(fā)揮的重要作用[8]。胰島β細胞系INS-1細胞株表達氧自由基清除酶少,對氧化應(yīng)激損傷高度敏感,本實驗采用該細胞株進行研究。已有多篇文獻證實抗氧化劑NAC能夠保護胰島β細胞的分泌功能[9],本研究用NAC處理后發(fā)現(xiàn),NAC+波動組及NAC+持續(xù)高糖組的細胞ATP含量及胰島素分泌能力分別較波動組及持續(xù)高糖組顯著增加,抗氧化劑可以顯著改善細胞ATP及胰島素分泌能力,提示波動性高糖及持續(xù)性高糖導(dǎo)致ATP合成減少可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。
綜上所述,波動性高糖及持續(xù)性高糖可能通過氧化應(yīng)激使ATP合成減少,且波動性高糖的程度更嚴重,最終導(dǎo)致INS-1細胞胰島素分泌功能的損傷。這為以后改善ATP合成以減少β細胞高糖毒性提供更多的理論依據(jù)。但波動性高糖及持續(xù)性高糖使ATP合成減少的許多具體機制仍未證實,有待進一步的研究。
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