高效液相色譜技術檢測β―地中海貧血的臨床價值探討-醫(yī)學論文

β―地中海貧血（β-thalassemia）簡稱β―地貧，是由于常染色體遺傳性缺陷，導致β―珠蛋白鏈的合成受到抑制或部分抑制而引起的一組嚴重危害的遺傳性溶血性貧血，常見于地中海，美國黑人，東南亞，印度次大陸以及中國地區(qū)，已成為全球性的公共健康問題^[1]。在我國，以長江以南各省發(fā)病率最高，其中廣西省，廣東省，福建省為β―地中海貧血高發(fā)區(qū)^[2]。目前，基因檢測是診斷β―地中海貧血的最可靠方法，但由于該實驗技術要求高，操作繁瑣，價格昂貴且不易進行有效的質量控制，故不適合于做大規(guī)模的人群篩查。而目前常規(guī)使用的平均紅細胞體積（MCV），平均血紅蛋白（MCH），紅細胞脆性試驗，血紅蛋白電泳等篩查方法，雖操作簡便，成本低廉，但又因其敏感性和特異性較低，人為影響因素較大，誤診和漏診現(xiàn)象較嚴重等問題，近年來已逐步開始被快速、準確、經濟的高效液相色譜法（HPLC）所取代。本文以反向斑點雜交（RDB）方法為金標準,使用24條探針,同時檢測中國人群中β―地中海貧血最常見的8個位點和9個少見位點突變，對已確診的128例β―地中海貧血攜帶者及53例正常對照，回顧性分析其HPLC血紅蛋白分析中的HbA2含量，從而評價HPLC法在β―地中海貧血中的診斷價值。

1資料與方法

1.1資料  2009年1月到2010年6月在我院遺傳門診咨詢的患者 308例，選擇經基因診斷證實為β―地中海貧血的患者128名（患病組）及非β―地中海貧血人群53名（對照組），年齡1至43周歲，抽取其靜脈血2毫升，EDTA抗凝。

1.2方法

1.2.1 HbA2含量測定 采用高效液相色譜法（HPLC）進行血紅蛋白分析，儀器為美國BIO-RAD公司VARIANTⅡ全自動血紅蛋白分析儀，使用配套試劑及質控品，嚴格按照儀器使用說明書進行操作。診斷標準：β―地中海貧血HbA2>4.0%。

1.2.2 β―地中海貧血基因診斷 采用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司的β―地中海貧血基因檢測試劑盒，經DNA擴增后，用膜反向雜交技術，使用24條探針，同時檢測中國人群常見的8個位點：CD41-42（-TCTT），IVS-2-654（C→T），CD17（A→T），-28（A→G），CD26（G→A），CD71-72（+A），CD43（G→T），-29（A→G）和9個少見位點突變：起始密碼子ATG→AGG，CD14-15（+G），CD27-28（+C），-32（C→A），-30（T→C），IVS-1-1（G→T），IVS-1-5（G→C），CD31（-C），CAP+40—+43（-AAAC）。操作嚴格按照說明書進行。

1.2.3試驗評價指標 按下列幾個參數(shù)對HPLC法在β―地中海貧血中的診斷價值進行評價，即靈敏度（Se）= a / (a + c)×100％，特異度（Sp）= d / (b +d)×100％，準確度（Ac）= (a + d)/ (a +b + c +d)×100％，陽性預測值（PPV）= a / (a + b)×100％，陰性預測值（NPV）= d / (c +d)×100％。其中a為HPLC法檢測患病組中的陽性數(shù)，b為該法檢測對照組中的陽性數(shù)，c為該法檢測患病組中的陰性數(shù)，d為該法檢測對照組中的陰性數(shù)。

2 結果

2.1  128例β―地中海貧血患者和53例對照中，其HPLC法檢測結果詳見表1。

      表1  HPLC法與基因分析法檢測β地貧結果比較

                               HPLC法（β地貧）

基因分析

陽性                         陰性

陽性                  127                          1

陰性                  2                            51

2.2 HPLC法用于β―地中海貧血診斷的臨床價值評價結果，詳見表2。

                 表2   HPLC法的實驗評價指標

 靈敏度Se  特異度Sp   準確度Ac  陽性預測值PPV  陰性預測值 NPV

     (%)        (%)        (%)            (%)              (%)

   99.2       96.2        98.3           98.4              98.1

2.3經基因檢測明確診斷的128例β―地中海貧血患者中，基因型分布情況及各基因型所占的比例，詳見表3

表3 β地貧基因型及所占百分比

基因突變類型                  例數(shù)（n）               百分比（%）

IVS-2-654（C→T）             67                      52.3

CD41-42（-TCTT）             37                      28.9

CD17（A→T）                 14                      10.9

-28（A→G）                   7                       5.5

CD27-28（+C）                 1                       0.8

CD43（G→T）                 1                        0.8

CD26（G→A）                 1                          0.8

3討論

β―地中海貧血是世界上最常見和發(fā)病率最高的遺傳性溶血性貧血,也是危害最嚴重的血紅蛋白病之一^[3]。由于該病至今尚無有效的治療方法，預防是最為有效的應對措施，而臨床上有相當一部分輕型或靜止型的β―地中海貧血患者沒有臨床癥狀，但卻攜帶致病基因，并可能將異?；蜻z傳給下一代，故如果夫妻雙方均為同一類型基因雜合子時，后代有四分之一的可能出現(xiàn)重型β―地中海貧血患兒，且此類患兒常在出生后幾個月就開始貧血，臨床癥狀嚴重，必須依靠長期輸血以維持生命，對社會和家庭都將帶來沉重的經濟和精神上的負擔，所以提倡婚前進行β―地中海貧血篩查及對未進行婚檢的孕婦進行產前β―地中海貧血篩查顯得尤其重要，對篩查出的高風險人群進行基因診斷，必要時對孕婦進行羊膜腔或臍靜脈穿刺，抽取羊水或臍血進行胎兒產前β―地中海貧血基因診斷，如確診為重癥患兒應建議給予引產，從而降低了圍產兒死亡率和出生缺陷兒發(fā)生率，對提高出生人口素質，切實做好優(yōu)生優(yōu)育工作具有重要意義。

目前，β―地中海貧血非基因檢測技術很多，如血常規(guī)，紅細胞滲透脆性試驗等^[4]，此類方法操作要求低，費用低廉，但敏感性差，特異性不高，且部分患者MCV及紅細胞滲透脆性試驗可以正常，是造成β―地中海貧血基因攜帶者漏診的主要原因，漏診率達到13.23％^[5]。而近來廣泛應用的血紅蛋白電泳法也存在著準確性和重復性不佳的缺點^[6]。故國際地貧協(xié)會現(xiàn)已推薦使用高效液相色譜法作為β―地貧常規(guī)篩查方法。HPLC是采用離子交換層析法自動快速分析血紅蛋白，此方法分離率高，可以把理化性質相差不大的混合物通過簡單的分離技術，使微小差異的各組分通過幾百次甚至幾千次的重復累積為大的差異而達到分離，特別適合于生物大分子如各種血紅蛋白組分的分離。而β―地中海貧血是由于β珠蛋白基因突變使β珠蛋白鏈合成受阻所致，此時機體為代償β珠蛋白鏈的減少，而使δ珠蛋白基因的轉錄升高，合成增加的δ珠蛋白易與相對過剩的α－珠蛋白鏈結合生成過多的HbA2。故通過檢測血紅蛋白中的HbA2含量，可以達到篩查β―地中海貧血的目的，若此值高于診斷標準，高度懷疑β―地中海貧血,建議做基因檢測以進一步明確診斷。

在本次研究中，我們對經基因確診的β―地中海貧血患者128例，及正常對照53名進行回顧性分析，從實驗靈敏度，特異度，準確度，陽性預測值和陰性預測值等方面對HPLC法進行了一個全面系統(tǒng)的評價，證實了HPLC的確為β―地中海貧血介于篩查與診斷之間的一個比較理想的方法。此外，對于研究中出現(xiàn)的一例β―地中海貧血基因攜帶者，其HPLC法測得的HbA2雖正常，但檢測中其HbF及血紅蛋白出峰圖譜均提示可能同時攜帶α―地貧，于是對其進行了α―地貧基因檢測，果然得到證實，故考慮該患者同時攜帶兩種地貧基因，由于α、β珠蛋白生成都減少，導致HbA2正常甚至可能偏低，從而掩蓋了β―地中海貧血HbA2增高的現(xiàn)象。與此相反，當出現(xiàn)HPLC法陽性，而常規(guī)基因位點分析未檢出突變的現(xiàn)象時，應考慮兩種可能存在，一是HPLC法檢測HbA2時，血紅蛋白D和E在HbA2被洗脫的同時也一起被洗脫下來，此外成分很少的HbS和其他類型的血紅蛋白也可與HbA2一同被洗脫，造成HbA2假性升高，但此種現(xiàn)象較少出現(xiàn)。二要結合臨床表現(xiàn)及其他實驗室檢查結果，對高度懷疑為β―地中海貧血的患者應考慮是否存在罕見的基因突變類型未在所檢測的基因位點之列，以防出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。在此次研究中，我們就對HPLC法陽性而常規(guī)基因分析陰性的其中一個標本進行了更深一步的研究剖析，最后明確其為一種國內外尚未見報道的新型β―地中海貧血基因突變類型，突變位點為Codon36(- C)，這也證實了在做常規(guī)基因分型的同時，用HPLC法進行血紅蛋白分析的重要性，它可充分彌補常規(guī)基因檢測類型較少的不足。此外，HPLC技術還可準確分析HbF，以及HbS等異常血紅蛋白帶^[7]，甚至能分離出血紅蛋白電泳所無法區(qū)分的條帶，且受人為因素影響小，實驗方便快速，費用低廉，檢測通量大，完全可以取代其他篩查方法用于臨床中β―地中海貧血的輔助診斷，尤其適用于大規(guī)模的人群篩查。

4 參考文獻

1 Vichin sky EP. Changing pattems of thalassemia worldwide[J]. Ann N Y Acad Sci,2005,1054(1):18-24.

2杜傳書. 地中海貧血研究的現(xiàn)狀與未來[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,1996,13(5):257

3鄭美琴，李偉，呂建新. 溫州地區(qū)漢族人群β―地中海貧血患者β珠蛋白基因突變分析[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2010,33(3):236

4覃西，毛煒，吳潔等. 非基因法檢測地中海貧血現(xiàn)狀[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2007,15(3):122-124

5朱學海，魏代奎.地中海貧血的基因診斷分析[J].中國實用醫(yī)藥,2008,3(13):126-127

6 Colah RB, SurveR, Sawant P, et al. HPLC studies in hemoglobinopathies [J] .Indian Pediatr,2007,74(7):657-662

7 Wajcman H. Diagnosis and screening of sickle cell disease [J]. Rev Prat,2004,54(14):1543-1547