大連櫻桃保藏過程致腐微生物分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

櫻桃（Cerasus spp.），又名車厘子，有“百果第一枝”的美譽。屬薔薇科李屬的多年生木本植物。櫻桃嬌小玲瓏，晶瑩剔透，圓若珍珠，赤若瑪瑙，被譽為“水果中的鉆石”。據(jù)《本草綱目》記載：“蛇咬，搗汁飲，并敷之”。櫻桃富含多酚和維生素C等多種營養(yǎng)成分，這些成分有助于減小慢性炎癥性疾病的患病風險，同時有助于減輕氧化壓力、炎癥、高血壓、關(guān)節(jié)炎、以及心血管疾病等健康問題。櫻桃還富含花色苷、紫蘇醇、堪非醇和褪黑激素等成分，具有較好的抗氧化作用。其游離二價鐵含量是菠菜的 3～5 倍，動物實驗表明其具有良好的補血效果。櫻桃果肉肉質(zhì)柔嫩，皮薄多汁，因此容易受損，從采摘到銷售，整個過程容易出現(xiàn)果梗干枯褐化和果實腐霉問題。據(jù)研究，葡萄孢屬 ( Botrytis sp.)、草酸青霉( Penicillium oxalicum)均能引起甜櫻桃腐爛。文章通過對大連櫻桃在貯藏過程中出現(xiàn)的腐爛組織塊進行研究，分離及純化出致病菌，并進行PCR擴增測定序列，進行其系統(tǒng)發(fā)展樹的繪制，為大連櫻桃的相關(guān)研究提供參考。

一、材料與方法

1.材料

（1）實驗材料。櫻桃，產(chǎn)地大連。

（2）試劑與儀器。70%乙醇、胰胳大豆胨培養(yǎng)基（TSB）、瓊脂粉、細菌基因組提取試劑盒、磁珠法細菌和真菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖、PCR 產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、電子天平、心機、PCR 儀、電泳儀、測序儀、BGI 2xSuper PCR Mix(with dye)、BGI D2000 Plus DNA Ladder

2.方法

（1）胰胳大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配備。按照胰胳大豆胨培養(yǎng)基（TSB）說明書，按比例配備胰胳大豆胨液體培養(yǎng)基，加入體積的18%配成胰胳大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。

（2）致病菌分離純化。通過手術(shù)刀切除腐爛部分的大連櫻桃，將這些腐爛組織塊浸泡70%乙醇溶液中，約30秒，迅速將其置于無菌紙上，使其吸干乙醇溶液。隨后，使用無菌水清洗組織塊，然后將它們植入預備好的TSA培養(yǎng)基中，在28℃的恒溫箱中培養(yǎng)48小時。

通過上述培養(yǎng)方法，獲得兩種形態(tài)不同的真菌。利用接種環(huán)進行挑離并劃線傳代。在分離純化3-4次后獲得兩株純菌株A₁和A₂。

（3）光學顯微鏡鏡檢。對從腐爛的大連櫻桃組織中分離并純化的兩個菌株A₁和A_2，在TSA平板上生長的菌落進行觀察，隨后，采用無菌針挑取菌落的一小部分，在光學顯微鏡下進行檢查，以研究菌落的外觀特征。

（4）基因組DNA提取

柱式法提取。取一個2 ml 的離心管，加入200 μL的預處理液和適量的小玻璃珠，然后加入相應量的菌樣品。將這混合物放入研磨儀中，進行充分混合的研磨。接著，加入20 μL Proteinase K，再加入200 μL的裂解液，充分顛倒混勻，隨后在70℃環(huán)境下放置10分鐘。然后，加入200 μL的無水乙醇，進行充分顛倒混勻，最后輕輕離心以去除管蓋內(nèi)的液滴。

進行吸附柱處理，使用洗滌液進行一次洗滌，隨后進行兩次漂洗液的洗滌。將吸附柱放置在室溫下3-5分鐘，確保吸附材料中的殘留漂洗液充分晾干。然后將吸附柱內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，向吸附膜的中間位置懸滴50～100 μL ddH₂O，在室溫下靜置3-5min，以12000rpm/min的速度離心2min，將溶液收集到離心管中。

磁珠法提取。按照試劑盒說明書分裝樣品板、磁珠板、洗滌板、洗脫板，并放置提取儀對應工位，運行細菌提取程序至結(jié)束。

（5）18S擴增。對真菌基因組DNA進行PCR擴增，使用表1中列出的引物。每個PCR反應體系的總體積為25 μL，其中PCR Mix占比21 μL，正向引物和反向引物各占比1 μL，模板DNA占比2 μL。擴增的程序和PCR反應條件可見表2。

表1  18S PCR擴增引物

表2  PCR 擴增反應體系和條件

（6）PCR產(chǎn)物分析和提純。取3 μL 的PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠檢測，以觀察DNA條帶的特征。通過凝膠成像分析系統(tǒng)檢查PCR擴增后的DNA條帶是否明顯。

為了純化PCR產(chǎn)物，采用了磁珠純化標準操作流程。該過程利用磁珠的原理，根據(jù)物質(zhì)的電荷特性，在高鹽和低pH條件下吸附DNA，然后在低鹽和高pH條件下釋放DNA，從而實現(xiàn)對DNA產(chǎn)物的分離和純化。

（7）測序。通過試劑盒對 PCR 得到的 DNA進行切膠回收，然后進行純化，最終進行測序分析。

（8）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。使用NCBI中的Blast工具將已測序的DNA與GenBank數(shù)據(jù)庫中已記錄的DNA序列進行比對，以尋找同源性相似性。如果 18S rDNA 序列的同源性大于98%，則被判定為同一個物種。為了計算遺傳距離，選取屬內(nèi)同源性較高的序列，并使用 Mega 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

二、結(jié)果與分析

1.致病菌分離生長結(jié)果。對大連櫻桃腐爛組織進行菌分離純化后，得到菌株A1及菌株A2，形態(tài)評價見表3。

表3  菌株A1與A2菌落形態(tài)評價

2.2光學顯微鏡鏡檢結(jié)果

取菌株A₁和A₂少許菌落組織在光學顯微鏡下觀察，菌A₁、菌A₂鏡檢結(jié)果評價見表4。

表4 菌株A₁與A₂菌落鏡檢結(jié)果評價

3 .PCR擴增與測序結(jié)果。對貯藏過程中大連櫻桃腐爛組織中分離純化的致病菌提取基因組DNA提取后，對其進行稀釋以制備PCR的反應模板。然后，使用真菌的18S rRNA區(qū)域，采用ITS1和ITS4引物進行PCR擴增。得到長度約為700 bp左右的序列。其瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果見圖1。在測序中，菌株A₂測序套峰，無法拼接比；菌株A₁正常。

4.發(fā)育樹繪制。從大連櫻桃腐爛組織中鑒定分離得到菌株A₁，將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，最終獲得菌株A₁的18S rDNA基因序列。將其18S rDNA基因序列與 GeneBank中的序列進行Blast，結(jié)果見表3，選取相近的典型菌株的基因序列，用 Mega 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。從所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看，A₁ 和 Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631(HQ847016.1)親緣關(guān)系較近。

表3 Blast結(jié)果

三、結(jié)論

從大連櫻桃保藏過程中腐爛組織中分離純化的菌種A₁，在形態(tài)及顯微鏡鏡檢下觀察，可見其菌落特征及形態(tài)上具有真菌特點。通過PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其和 Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631(HQ847016.1)有較近的親緣關(guān)系，為后續(xù)研究櫻桃保藏提供理論基礎。

文章來源：《中國食品》  http://www.12-baidu.cn/w/qt/29400.html